该协议将告诉你如何染色微胶质，执行定量密度和形态分析，以及量化巨噬细胞渗透到大脑。该技术允许研究人员以定量方式测量微胶质分布和形态的变化，并区分微胶质与渗透巨噬细胞这种分析方案可以很容易地应用于其他动物模型，以测量微胶质分布和形态的变化，其中抗 IBA1 和抗TMEM119抗体可用。强烈建议进行与实验条件盲的细胞计数和痕迹，并在执行此程序的方式保持一致。
要开始此过程，请打开安装了最近邻居距离插件的图像处理程序，如斐济或 ImageJ。如果比例包含在文件的元数据中，并且不会从元数据自动设置，则打开 20X 映像。在菜单栏上，选择"分析"，设置比例，然后输入正确的信息。
要根据图像上刻印的刻度手动设置比例，请选择"直线"工具。将光标放在比例的边缘，在按 Shift 键时，绘制一条尽可能靠近图像比例的线。选择"分析"，设置比例。
将弹出一个窗口，并设置正确的已知距离和长度单位，以确定像素的每个长度单位，然后单击"确定"。接下来，选择"图像、颜色、合成"以创建所有通道的复合图像。在菜单栏上，选择"分析"，"设置测量值"。检查区域、中心和周长。
在"重定向到"下拉菜单中，选择"打开"文件，然后单击"确定"。转到"图像、颜色、通道工具"以打开通道工具。使用"手绘选择"工具绘制感兴趣区域周围的粗糙周长。双击工具栏上的椭圆形工具以启用选择画笔工具。
确保选中"启用选择画笔"框，然后单击"确定"。使用选择画笔，调整周长以最适合感兴趣的区域，然后在整个区域中按键盘上的 T 以箭头 Y 管理器。选择"分析"、测量或按 M 键，结果窗口将弹出。将结果复制并粘贴到数据手册中，并保存有关区域的信息。
复制感兴趣区域的区域后，通过单击"结果"窗口并按"退格"键来基础信息。选择 ROI 管理器窗口，选择 ROI 跟踪，然后通过按"重命名"更改名称以匹配图像名称。单击"确定"，然后右键单击 ROI 跟踪的新名称并保存。
双击工具栏中的"画笔"工具。选择黑色和画笔大小 10。确保"叠加上绘制"选项未选中。
在 TMEM119 通道中，小心地在每个 TMEM119 正微胶质的 soma 中心放置一个黑点。将白点放在对 TMEM119 不呈阳性的单元格中心。对感兴趣区域中包含的所有单元格重复相同的过程。
接下来，选择"图像、颜色、分割通道"，将显示每个通道的窗口。标识具有点注的通道，并关闭其他两个窗口。要重定向新的拆分通道图像，请转到"分析"，设置测量。
在"重定向到下拉菜单"中，选择"拆分通道图像"并单击"确定"。然后选择"图像""键入"八位。转到图像调整并选择阈值。在两个条形中向左调整滑块。
这将只留下黑点，现在将显示为白色。在 ROI 管理器窗口中选择感兴趣的区域。在"菜单"栏中，选择"分析"，"分析粒子"。
在"大小"的文本框中，输入 1 到 20。像素单位的框应保持未选中状态，而显示结果的框应选中"汇总"和"添加到管理器"。单击"确定"以显示"摘要"窗口，该窗口将给出点数。
将此信息复制并粘贴到数据手册中。然后，选择插件 NND 以显示 NND 窗口。每个数字表示每个微胶质与最近相邻微胶的距离。
将所有这些信息复制并粘贴到数据手册中。返回"阈值"窗口，并将顶部滑块一直向右调整，这会保持所有白点可见，现在显示为白色。选择"分析"，"分析粒子"以显示"分析粒子"弹出窗口。
单击"确定"以显示提供点数的"摘要"窗口。将此信息复制并粘贴到数据手册中。转到 ROI 管理器并选择所有点。
然后右键单击并保存图像的名称。这将允许保存 ZIP 文件中的所有点。首先，打开 4DX 图像文件。
将出现一个弹出窗口，询问是否应该在堆栈中打开图像。单击"确定"。接下来，选择"图像、堆栈"和"Z 项目"以打开 Z 投影窗口。包括从第一个切片到最后一个切片的所有切片。
确保在"投影类型"下选择"最大强度"，然后单击"确定"。单击包含 ZProject 的新窗口。选择图像、颜色、分割通道，并在 IBA1 通道的图像上执行跟踪。在"菜单"栏中，选择"分析"、设置测量。
检查区域、中心和周长。在"重定向到"下拉菜单中，选择打开的文件，然后单击"确定"。要根据图像上刻印的刻度手动设置比例，请选择"直线"工具。将光标放在比例的边缘，在按 Shift 键时，绘制一条尽可能靠近图像比例的线。
选择"分析"，设置比例。将弹出一个窗口。输入正确的已知距离和长度单位，以确定每个长度单位的像素，然后单击"确定"。要测量 IBA1 通道中的索马大小，请使用"手绘选择"工具绘制索马的粗糙周长。
双击工具栏上的"椭圆形"工具以启用"选择画笔"工具。确保选中"启用选择画笔"框，然后单击"确定"。使用"选择画笔"，调整轨迹以最适合 soma。在此步骤中，放大将启用精度。
接下来，按 T 键将 soma 跟踪添加到 ROI 管理器。选择"分析"、测量或按 M 键以显示结果。复制这些结果并将其粘贴到数据手册中。
转到 ROI 管理器窗口，选择感兴趣的区域，然后通过按"重命名"更改名称以匹配图像的名称。右键单击重命名的感兴趣区域，然后单击"保存"。确保名称指定跟踪是 soma 的，并保存该文件。
要测量 IBA1 通道中的轴化区域，请首先选择多边形选择工具。使用该工具单击微胶质过程四肢以启动多边形形状。单击每个过程四肢的尖端，形成一个多边形，最好地表示微胶中覆盖的区域， 在微胶中四周。
当多边形完成时，单击起点以关闭它。然后，按 T 键将跟踪添加到 ROI 管理器。选择"分析、测量"或按 M 键将数据添加到"结果"窗口。
将此数据复制并粘贴到数据手册中。若要保存有关树化区域的信息，请转到 ROI 管理器窗口，选择感兴趣的区域，然后通过按"重命名"更改名称以匹配图像的名称。右键单击重命名的感兴趣区域，然后单击"保存"。
确保名称指定跟踪用于轴化并保存文件。本研究描述了 IBA1 和 TMEM119 免疫荧光共染色的分步工作流程，以及微胶质密度、分布和形态以及小鼠脑组织内周围骨髓细胞渗透的分析。荧光显微镜用于在20倍放大倍率下，使用 IBA1 和 TMEM119 在背海马的冠状部分对微胶质的共标记进行成像。
成功的染色揭示了微胶质细胞体及其精细过程。染色允许确定微胶质密度和分布，并用于识别微胶质簇和渗透巨噬细胞。共体显微镜用于以 40 倍的放大倍率对步进微胶状跟踪过程进行成像。
这些代表性的结果显示，IBA1阳性和TMEM119阳性微胶质以及细胞体追踪的例子。在计数细胞时保持一致，并注意 IBA1 和 TMEM119 的信号非常重要。这种技术使研究人员能够识别受特定刺激影响的大脑区域，然后通过补充技术更深入地研究这些区域。
