이 프로토콜은 미세 glia를 염색하는 방법을 보여줍니다, 양적 밀도 및 형태 분석을 수행뿐만 아니라 뇌에 대식세포 침투를 정량화. 이 기술을 통해 연구원은 미생물 분포 및 형태학의 변화를 정량적 방법으로 측정하고 마이크로글리아를 침투하는 대식세포로부터 분화할 수 있으며, 이 분석 프로토콜은 다른 동물 모델에 쉽게 적용되어 항 IBA1 및 항 TMEM119 항체가 제공되는 마이크로글리아 분포 및 형태학의 변화를 측정할 수 있습니다. 실험 조건에 눈이 멀게 된 세포 수와 흔적을 수행하고 이 절차가 수행되는 방식으로 일관성을 가지는 것이 좋습니다.
이 절차를 시작하려면 가장 가까운 이웃 거리 플러그인이 설치된 피지 또는 ImageJ와 같은 이미지 처리 프로그램을 엽니 다. 크기조정이 파일의 메타데이터에 포함되어 있고 메타데이터에서 자동으로 설정되지 않으면 20X 이미지를 엽니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 설정 배율 조정을 선택한 다음 올바른 정보를 입력합니다.
이미지에 각인된 배율에 따라 수동으로 배율을 설정하려면 직선 도구를 선택합니다. 커서를 축척 가장자리에 놓고 Shift 키를 누르면 이미지의 배율에 가능한 한 가깝게 선을 그립니다. 분석, 설정 배율 선택
창이 튀어나와 길이 단위당 픽셀을 결정하고 확인을 클릭하기 위해 정확한 알려진 거리 와 길이 단위를 배치합니다. 다음으로 이미지, 색상, 컴포지트 만들기를 선택하여 모든 채널의 합성 이미지를 만듭니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 측정 설정 을 선택합니다. 영역, 센트로이드 및 둘레를 확인합니다.
리디렉션 투 드롭다운 메뉴에서 열기 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 채널 도구를 열려면 이미지, 색상, 채널 도구로 이동합니다. Freehand 선택 도구를 사용하여 관심 지역 주변의 거친 경계를 그립니다. 도구 모음의 타원형 도구를 두 번 클릭하여 선택 브러시 도구를 사용할 수 있습니다.
선택 지원 브러시 상자가 선택 확인되어 확인을 클릭했는지 확인합니다. 선택 브러시를 사용하여 관심 영역에 가장 잘 맞게 둘레를 조정한 다음 이 영역 전체의 키보드에서 T를 눌러 Y 관리자화살표로 이동합니다. M 키 분석, 측정 또는 누릅니다. 결과를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣고 영역에 대한 정보를 저장합니다.
관심 영역영역을 복사한 후 결과 창에서 정보를 클릭하고 백스페이스 키를 눌러 정보를 기반으로 합니다. ROI 관리자 창을 선택하고 ROI 추적을 선택하고 이름 바꾸기를 눌러 이미지 이름과 일치하도록 이름을 변경합니다. 확인을 클릭한 다음 ROI 추적의 새 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 저장합니다.
도구 표시줄에서 브러시 도구를 두 번 클릭합니다. 색상 검정색과 브러시 크기가 10을 선택합니다. 오버레이에 페인트 옵션을 선택하지 않았는지 확인합니다.
TMEM119 채널에서는 각 TMEM119 포지티브 마이크로글리아에 대해 소마 중앙에 검은 점을 조심스럽게 배치합니다. TMEM119에 대해 긍정적이지 않은 셀의 중앙에 흰색 점을 놓습니다. 관심 영역에 포함된 모든 셀에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
다음으로 이미지, 색상, 분할 채널을 선택하면 각 채널에 대한 창이 나타납니다. 점 주석이 있는 채널을 식별하고 다른 두 창을 닫습니다. 새 분할 채널 이미지를 리디렉션하려면 측정 을 설정하여 분석으로 이동합니다.
리디렉션에서 드롭다운 메뉴에서 분할 채널 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 이미지, 유형, 8비트를 선택합니다. 이미지 조정으로 이동하여 임계값을 선택합니다. 슬라이더를 두 막대의 왼쪽끝까지 조정합니다.
이렇게 하면 이제 흰색으로 표시되는 검은 점만 남게 됩니다. ROI 관리자 창에서 관심 영역을 선택합니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 파티클 분석 을 선택합니다.
크기에 대한 텍스트 상자에 입력하여 20까지 입력합니다. 픽셀 단위의 상자는 디스플레이 결과, 요약 및 관리자 추가에 대한 상자를 선택해야 하는 동안 선택 되지 않은 상태로 유지 해야 합니다. 확인을 클릭하여 포인트 수를 줄 요약 창을 표시합니다.
이 정보를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣습니다. 그런 다음 NND 창을 표시하려면 플러그인 NND를 선택합니다. 각 숫자는 각 마이크로글리아가 가장 가까운 이웃 마이크로글리아에 가하는 거리를 나타냅니다.
이 모든 정보를 데이터 시트에 복사하여 붙여 넣습니다. 임계값 창으로 돌아가 서 오른쪽끝까지 상단 슬라이더를 조정하면 모든 흰색 점이 표시되고 흰색점이 모두 표시됩니다. 분석, 분석 파티클 분석 을 선택하여 파티클 분석 창이 나타납니다.
확인을 클릭하여 점 수를 제공하는 요약 창을 표시합니다. 이 정보를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣습니다. ROI 관리자로 이동하여 모든 포인트를 선택합니다.
그런 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이미지 이름으로 저장합니다. 이렇게 하면 ZIP 파일의 모든 점을 절약할 수 있습니다. 먼저 4DX 이미지 파일을 엽니다.
스택에서 이미지를 열지 묻는 팝업 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다. 다음으로 이미지, 스택, ZProject를 선택하여 Z 프로젝션 창을 엽니다. 첫 번째 슬라이스부터 마지막 슬라이스까지 의 모든 슬라이스를 포함합니다.
프로젝션 유형에서 최대 강도가 선택되었는지 확인하고 확인을 클릭합니다. ZProject가 포함된 새 창을 클릭합니다. 이미지, 색상, 분할 채널을 선택하고 IBA1 채널의 이미지에 대한 추적을 수행합니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 측정 설정 을 선택합니다.
영역, 센트로이드 및 둘레를 확인합니다. 리디렉션에서 드롭다운 메뉴에서 열린 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다. 이미지에 각인된 배율에 따라 수동으로 배율을 설정하려면 직선 도구를 선택합니다. 커서를 축척 가장자리에 놓고 Shift 키를 누르면 이미지의 배율에 가능한 한 가깝게 선을 그립니다.
분석, 설정 배율 선택 창이 나타납니다. 길이 단위당 픽셀을 결정하고 확인을 클릭하여 올바른 알려진 거리 및 길이 단위를 입력합니다. IBA1 채널에서 소마 크기를 측정하려면 프리핸드 선택 도구를 사용하여 소마의 거친 둘레를 그립니다.
도구 모음의 타원형 도구를 두 번 클릭하여 선택 브러시 도구를 활성화합니다. 선택 지원 브러시 상자가 선택 확인되어 확인을 클릭했는지 확인합니다. 선택 브러시를 사용하여 추적을 조정하여 소마에 가장 잘 맞춥습니다. 확대하면 이 단계에서 정밀도가 가능합니다.
다음으로 T 키를 눌러 ROI 관리자에 소마 흔적을 추가합니다. 결과를 표시하려면 M 키 분석, 측정 또는 누릅니다. 이러한 결과를 데이터 시트에 복사하여 붙여넣습니다.
ROI 관리자 창으로 이동하여 관심 영역을 선택하고 이름 바꾸기를 눌러 이미지 이름에 맞게 이름을 변경합니다. 이름이 변경된 관심 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 저장을 클릭합니다. 이름이 추적이 소마에 대한 것인지 지정하고 파일을 저장해야 합니다.
IBA1 채널에서 중단 영역을 측정하려면 먼저 다각형 선택 도구를 선택합니다. 다각형 모양을 시작하는 도구를 사용하여 마이크로글리아 프로세스 극단을 클릭합니다. 각 공정 말단의 끝을 클릭하여 마이크로글리아 를 돌아다니며 미세 글리아 소각으로 덮인 영역을 가장 잘 나타내는 다각형을 형성하십시오.
다각형이 완료되면 시작 지점을 클릭하여 닫습니다. 그런 다음 T 키를 눌러 ROI 관리자에 흔적을 추가합니다. M 키 분석, 측정 또는 누릅니다.
이 데이터를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣습니다. 중단 영역에 대한 정보를 저장하려면 ROI 관리자 창으로 이동하여 관심 영역을 선택하고 이름 바꾸기를 눌러 이미지 이름에 맞게 이름을 변경합니다. 이름이 변경된 관심 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 저장을 클릭합니다.
이름이 추적이 중단을 위한 것인지 지정하고 파일을 저장해야 합니다. 이 연구는 IBA1 및 TMEM119의 면역 형광 공동 염색및 마이크로글리아밀도, 분포 및 형태학뿐만 아니라 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투의 분석을 위한 단계별 워크플로우를 기술했다. 형광 현미경 검사는 20배율에서 등쪽 해마의 관상 섹션에서 IBA1 및 TMEM119를 사용하여 마이크로글리아의 공동 라벨링을 이미지화하는 데 사용됩니다.
성공적인 염색은 마이크로글리아 세포 체와 그들의 미세한 과정을 보여줍니다. 염색은 마이크로글리아밀도 및 분포의 측정과 마이크로글리아 클러스터의 식별 및 침투 대식세포에 대한 수 있습니다. 공초점 현미경 검사는 40X 배율에서 단계적 미세glial 석습 추적 절차를 이미지하는 데 사용됩니다.
이러한 대표적인 결과는 IBA1 양성 및 TMEM119 양성 마이크로글리아뿐만 아니라 세포 체추적의 예를 보여줍니다. 세포를 계산할 때 일관성을 유지해야 하며 IBA1 과 TMEM119의 두 신호모두에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구원이 상호 보완적인 기술로 더 깊이 공부할 수 있는 특정 자극에 의해 영향을 받는 두뇌의 지구를 확인하는 것을 허용합니다.
