פרוטוקול זה יראה לך כיצד להכתים microglia, לבצע צפיפות כמותית וניתוח מורפולוגיה, כמו גם לכמת חדירת מקרופאג לתוך המוח. טכניקה זו מאפשרת לחוקר למדוד שינויים בהפצת מיקרוגליה ומורפולוגיה באופן כמותי ולהבדיל בין מיקרוגליה לבין חדירת מקרופאגים פרוטוקול ניתוח זה יכול להיות מיושם בקלות על מודלים אחרים של בעלי חיים כדי למדוד שינויים בהפצה מיקרוגליאלית ומורפולוגיה שבהם זמינים נוגדנים נגד IBA1 ואנטי TMEM119. מומלץ מאוד לבצע את ספירת התאים ואת העקבות עיוורים למצב הניסיוני להיות עקבי באופן שבו הליך זה מבוצע.
כדי להתחיל בהליך זה, פתח תוכנית לעיבוד תמונה כגון Fiji או ImageJ שבה מותקן תוסף מרחק השכן הקרוב ביותר. פתחו את התמונה 20X אם קנה המידה כלול במטא-נתונים של הקובץ ולא מוגדר אוטומטית מהמטא-נתונים. שורת התפריטים, בחר נתח, הגדר קנה מידה ולאחר מכן הזן את המידע הנכון.
להגדרה ידנית של קנה המידה בהתאם לקנה מידה המוטבע בתמונה, בחרו בכלי קו ישר. מקם את הסמן בקצה קנה המידה ובזמן הקשה על מקש Shift, צייר קו קרוב ככל האפשר לשינוי קנה המידה בתמונה. בחר נתח, הגדר קנה מידה.
חלון יצץ ויניח את המרחק הידוע ואת יחידת האורך הנכונים כדי לקבוע את יחידת הפיקסל לכל אורך ולחוץ על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'צור ללא הפרדות צבע' ליצירת תמונה ללא הפרדות צבע מכל הערוצים. שורת התפריטים, בחר נתח, הגדר מידות. בדוק את האזור, המרכז וההיקף.
בתפריט הנפתח נתב מחדש אל, בחר בקובץ הפתיחה ולאחר מכן לחץ על אישור. עבור אל תמונה, צבע, כלי ערוץ לפתיחת הכלי ערוץ. השתמש בכלי בחירה ביד חופשית כדי לצייר היקף מחוספס סביב אזור העניין. לחצו פעמיים על הכלי אליפסה ב סרגל הכלים כדי להפוך את הכלי מברשת הבחירה לזמין.
ודאו שהתיבה 'הפוך מברשת בחירה לזמינה' מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר'. באמצעות מברשת הבחירה, התאימו את ההיקף כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לאזור העניין, ולאחר מכן הקישים T על המקלדת באזור זה כדי ללחוץ על מנהל Y של החץ. בחרו 'נתח', 'מדוד' או הקש על מקש M וחלון 'תוצאות' יצצים. העתק והדבק את התוצאות לתוך גליון נתונים ושמור את המידע הנוגע לאזור.
לאחר העתקת האזור של אזור העניין, אתה מבסס את המידע מחלון התוצאות על-ידי לחיצה עליו והקשה על מקש Backspace. בחר בחלון מנהל ההשקעות, בחר את מעקב ROI ושנה את השם כך שיתאימו לשם התמונה על-ידי הקשה על שנה שם. לחץ על אישור ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם החדש של המעקב והשמור של ROI.
לחצו פעמיים על הכלי מברשת ב סרגל הכלים. בחרו בצבע שחור ובגודל המברשת של 10. ודא שהאפשרות 'צייר על שכבת-על' אינה מסומנת.
בערוץ TMEM119, מקם בזהירות נקודה שחורה במרכז ה- soma עבור כל מיקרוגליה חיובית TMEM119. מקם נקודה לבנה במרכז התאים אינם חיוביים עבור TMEM119. חזור על אותו הליך עבור כל התאים הכלולים באזור העניין.
לאחר מכן, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'פיצול ערוץ', יופיע חלון לכל ערוץ. זהה את הערוץ עם ביאורי הנקודות וסגור את שני החלונות האחרים. כדי לנתב מחדש את תמונת הערוץ המפוצל החדשה, עבור אל נתח, הגדר מידות.
בתפריט הנפתח נתב מחדש אל, בחר בתדמית פיצול ערוץ ולחץ על אישור. לאחר מכן בחרו 'תמונה', 'הקלד', 'שמונה סיביות'. עבור אל התאמת תמונה ובחר סף. כוונן את המחוונים כל הדרך שמאלה בשני מייצגי הפעילויות.
פעולה זו תשאיר רק את הנקודות השחורות שיופיעו כעת בלבן. בחר את אזור העניין בחלון מנהל ההשקעות. שורת התפריטים, בחר נתח, נתח חלקיקים.
בתיבת הטקסט עבור גודל, הזן אחד עד 20. התיבה עבור יחידות פיקסלים צריכה להישאר לא מסומנת כאשר יש לבדוק את התיבה עבור תוצאות תצוגה, סיכום והוספה למנהל. לחץ על אישור כדי להציג את חלון הסיכום שייתן את מספר הנקודות.
העתק והדבק מידע זה בגיליון הנתונים. לאחר מכן, בחר תוספים NND כדי להציג את חלון NND. כל מספר מייצג את המרחק שיש לכל מיקרוגליה למיקרוגליה השכנה הקרובה ביותר.
העתק והדבק את כל המידע הזה בגיליון הנתונים. חזור לחלון הסף והתאם את המחוון העליון כל הדרך ימינה, מה שישיר את כל הנקודות הלבנות גלויות, שנראות כעת לבנות. בחרו 'נתח', 'נתח חלקיקים' כדי להציג את החלון הנפתח 'נתח חלקיקים'.
לחץ על אישור כדי להציג את חלון הסיכום המספק את מספר הנקודות. העתק והדבק מידע זה בגיליון הנתונים. עבור אל מנהל ההשקעות (ROI Manager) ובחר את כל הנקודות.
לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ושמור עם שם התמונה. פעולה זו תאפשר שמירה של כל הנקודות בקובץ ZIP. ראשית, פתחו את קובצי התמונה של 4DX.
יופיע חלון מוקפץ שישאל אם יש לפתוח את התמונות בערימה. לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תמונה, ערימות, ZProject כדי לפתוח את חלון הקרנה Z. כלול את כל הפרוסות מהפרוסה הראשונה עד האחרונה.
ודא שהעוצמה המרבית נבחרה תחת סוג הקרנה ולחץ על אישור. לחץ על החלון החדש המכיל את ZProject. בחרו 'תמונה', 'צבעים', 'פיצול ערוצים' ונהלו את המעקבים בתמונות של ערוץ IBA1. שורת התפריטים, בחרו 'נתח', 'קבע מידות'.
בדקו את האזור, המרכז וההיקף. בתפריט הנפתח נתב מחדש אל, בחר את הקובץ הפתוח ולחץ על אישור. להגדרה ידנית של קנה המידה בהתאם לקנה מידה המוטבע בתמונה, בחרו בכלי קו ישר. מקם את הסמן בקצה קנה המידה ובזמן הקשה על מקש Shift, צייר קו קרוב ככל האפשר לשינוי קנה המידה בתמונה.
בחר נתח, הגדר קנה מידה. חלון יצץ. הזן את המרחק הידוע ואת יחידת האורך הנכונים כדי לקבוע את יחידת הפיקסלים לכל אורך ולחץ על אישור. כדי למדוד את גודל soma בערוץ IBA1, לצייר היקף מחוספס של soma עם הכלי בחירה ביד חופשית.
לחצו פעמיים על הכלי אליפסה בסרגל הכלים כדי להפוך את הכלי מברשת בחירה לזמין. ודאו שהתיבה 'הפוך מברשת בחירה לזמינה' מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר'. בעזרת מברשת הבחירה, כווננו את המעקב כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לסומה. התקרבות תאפשר דיוק במהלך שלב זה.
לאחר מכן, הקש על מקש T כדי להוסיף את מעקב soma למנהל ההשקעות. בחר נתח, למדוד או הקש על מקש M כדי להציג את התוצאות. העתק והדבק תוצאות אלה בגיליון נתונים.
עבור אל חלון מנהל ההשקעות, בחר את אזור העניין ושנה את השם כך שיתאימו לשם התמונה על-ידי הקשה על שנה שם. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אזור העניין ששמו שונה ולחץ על שמור. ודא שהשם מציין שהמעקב הוא עבור soma ושמור את הקובץ.
למדידת אזור ארבוריזציה בערוץ IBA1, בחרו תחילה בכלי בחירת מצולע. לחץ על גפיים תהליך microglial עם הכלי כדי להתחיל את צורת המצולע. הסתובב במיקרוגליה על ידי לחיצה על קצות כל תהליך כדי ליצור מצולע המייצג בצורה הטובה ביותר את האזור המעובד על ידי ההתארגנויות המיקרוגליאליות.
לאחר השלמת המצולע, לחץ על נקודת ההתחלה כדי לסגור אותו. לאחר מכן, הקש על מקש T כדי להוסיף את המעקב למנהל ההשקעות. בחר נתח, למדוד או הקש על מקש M כדי להוסיף את הנתונים לחלון תוצאות.
העתק והדבק נתונים אלה בגיליון הנתונים. כדי לשמור את המידע אודות אזור האחזור מחדש, עבור לחלון מנהל ההשקעות, בחר את אזור העניין ושנה את השם כך שיתאימו לשם התמונה על-ידי הקשה על שנה שם. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אזור העניין ששמו שונה ולחץ על שמור.
ודא שהשם מציין שהמעקב הוא לצורך סידור מחדש ושמור את הקובץ. מחקר זה תיאר את זרימת העבודה צעד אחר צעד עבור כתמים משותפים immunofluorescent של IBA1 ו TMEM119 וניתוח של צפיפות microglial, הפצה ומורפולוגיה, כמו גם של חדירת תאים מיאלואידיים היקפיים ברקמת המוח העכבר. מיקרוסקופיה פלואורסצנטי משמשת לתווית שותף של מיקרוגליה באמצעות IBA1 ו- TMEM119 בחלק הקורונה של ההיפוקמפוס הגבי בהגדלה של פי 20.
הכתמה מוצלחת חושפת את גופי התאים המיקרוגליאליים ואת התהליכים העדינים שלהם. הכתמים מאפשרים קביעת צפיפות והתפלגות מיקרוגליאלית וזיהוי אשכולות מיקרוגליאליים ומאקרופאגים חודרים. מיקרוסקופ קונפוקלי משמש כדי לדמיין את הליך המעקב ארבוריזציה microglial צעד בהגדלה 40X.
תוצאות מייצגות אלה מראות IBA1 חיובי TMEM119 microglia חיובי, כמו גם דוגמה של מעקב גוף התא. חשוב להיות עקבי בעת ספירת תאים לשים לב לשני האותות של IBA1 ו TMEM119. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לזהות אזורים במוח המושפעים מגירוי מסוים אשר לאחר מכן ניתן ללמוד לעומק יותר עם טכניקות משלימות.
