Dieses Protokoll zeigt Ihnen, wie Sie Mikroglia färben, quantitative Dichte- und Morphologieanalysen durchführen sowie die Makrophageninfiltration in das Gehirn quantifizieren können. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, Veränderungen in der Mikrogliaverteilung und Morphologie auf quantitative Weise zu messen und Mikroglia von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden Dieses Analyseprotokoll kann leicht auf andere Tiermodelle angewendet werden, um Veränderungen in der mikroglianverteilung und Morphologie zu messen, wo Anti-IBA1- und Anti-TMEM119-Antikörper verfügbar sind. Es wird dringend empfohlen, die Zellzahl und Diespuren für den experimentellen Zustand zu führen und in der Art und Weise, wie dieses Verfahren durchgeführt wird, konsistent zu sein.
Um dieses Verfahren zu starten, öffnen Sie ein Bildverarbeitungsprogramm wie Fidschi oder ImageJ, das das nächste Nachbar-Entfernungs-Plug-in installiert hat. Öffnen Sie das 20X-Bild, wenn der Maßstab in den Metadaten der Datei enthalten ist und nicht automatisch aus den Metadaten festgelegt wird. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Skalieren festlegen aus, und geben Sie dann die richtigen Informationen ein.
Um den Maßstab manuell basierend auf einem auf dem Bild aufgedruckten Maßstab festzulegen, wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus. Platzieren Sie den Cursor am Rand der Skala, und zeichnen Sie beim Drücken der Umschalttaste eine Linie so nah wie möglich an den Maßstab auf dem Bild. Wählen Sie Analysieren, Skalieren festlegen.
Ein Fenster wird angezeigt und die richtige bekannte Entfernung und Längeneinheit gesetzt, um die Pixelpro-Länge-Einheit zu bestimmen, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie als Nächstes Bild, Farbe, Zusammengesetzt erstellen aus, um ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle zu erstellen. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Messen festlegen aus. Prüfbereich, Schwerpunkt und Perimeter.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Umleiten die Datei öffnen aus und klicken Sie dann auf OK. Wechseln Sie zu Bild, Farbe, Kanalwerkzeug, um das Kanalwerkzeug zu öffnen. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um einen groben Umfang um den Interessenbereich zu zeichnen. Doppelklicken Sie auf das Oval-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um das Auswahl-Pinselwerkzeug zu aktivieren.
Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Auswahlpinsel aktivieren aktiviert ist, und klicken Sie auf OK. Passen Sie mit dem Auswahlpinsel den Umfang an den Interessenbereich an, und drücken Sie dann T auf der Tastatur in diesem Bereich, um den Pfeil Y-Manager zu erreichen. Wählen Sie Analysieren, Messen oder Drücken Sie die M-Taste, und das Ergebnisfenster wird angezeigt. Kopieren und fügen Sie die Ergebnisse in ein Datenblatt ein, und speichern Sie die Informationen über den Bereich.
Nachdem Sie den Bereich des Interessenbereichs kopiert haben, basieren Sie die Informationen aus dem Ergebnisfenster, indem Sie darauf klicken und die Rückraumtaste drücken. Wählen Sie das Fenster ROI-Manager aus, wählen Sie die ROI-Ablaufverfolgung aus, und ändern Sie den Namen, um dem Namen des Bildes zu entsprechen, indem Sie die Umbenennung drücken. Klicken Sie auf OK, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den neuen Namen der ROI-Ablaufverfolgung, und speichern Sie ihn.
Doppelklicken Sie in der Werkzeugleiste auf das Pinselwerkzeug. Wählen Sie die Farbe Schwarz und die Pinselgröße 10 aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Paint on overlay deaktiviert ist.
Legen Sie im TMEM119-Kanal vorsichtig einen schwarzen Punkt auf die Mitte des Soma für jede TMEM119 positive Mikroglia. Platzieren Sie einen weißen Punkt in der Mitte der Zellen, die für TMEM119 nicht positiv sind. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für alle Zellen, die im Interessenbereich enthalten sind.
Als Nächstes wählen Sie Bild, Farbe, Split-Kanal, ein Fenster für jeden Kanal wird angezeigt. Identifizieren Sie den Kanal mit den Punktanmerkungen, und schließen Sie die beiden anderen Fenster. Um das neue Split-Channel-Bild umzuleiten, gehen Sie zu Analysieren, Messen festlegen.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Umleiten das Split Channel Image aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann Bild, Typ, Achtbit. Wechseln Sie zu Bildanpassung, und wählen Sie Schwellenwert aus. Passen Sie die Schieberegler in beiden Balken ganz nach links an.
Dadurch werden nur noch die schwarzen Punkte belassen, die nun weiß erscheinen. Wählen Sie im Fenster ROI Manager die Interessenregion aus. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Partikel analysieren aus.
Geben Sie im Textfeld für Größe eins bis 20 ein. Das Kontrollkästchen für Pixel-Einheiten sollte deaktiviert bleiben, während das Kontrollkästchen für Anzeigeergebnisse, Zusammenfassen und Hinzufügen zum Manager aktiviert werden soll. Klicken Sie auf OK, um das Fenster Zusammenfassung anzuzeigen, in dem die Anzahl der Punkte angezeigt wird.
Kopieren Sie diese Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Wählen Sie dann Plug-Ins NND aus, um das NND-Fenster anzuzeigen. Jede Zahl stellt den Abstand jeder Mikroglia zur nächsten benachbarten Mikroglia dar.
Kopieren Sie alle diese Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Gehen Sie zurück zum Fenster Schwellenwert und passen Sie den oberen Schieberegler ganz rechts an, wodurch alle weißen Punkte sichtbar sind, die nun weiß angezeigt werden. Wählen Sie Analysieren, Partikel analysieren, um das Pop-up-Fenster "Partikel analysieren" anzuzeigen.
Klicken Sie auf OK, um das Fenster Zusammenfassung anzuzeigen, das die Anzahl der Punkte bereitstellt. Kopieren Sie diese Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Wechseln Sie zum ROI Manager, und wählen Sie alle Punkte aus.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und speichern Sie mit dem Namen des Bildes. Dies ermöglicht das Speichern aller Punkte in einer ZIP-Datei. Öffnen Sie zunächst die 4DX-Bilddateien.
Es wird ein Popup-Fenster angezeigt, in dem sie gefragt wird, ob die Bilder in einem Stapel geöffnet werden sollen. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie als Nächstes Bild, Stapel, ZProject aus, um das Fenster Z-Projektion zu öffnen. Schließen Sie alle Slices vom ersten bis zum letzten Slice ein.
Stellen Sie sicher, dass die maximale Intensität unter Projektionstyp ausgewählt ist, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf das neue Fenster, das das ZProject enthält. Wählen Sie Bild, Farben, Split-Kanäle und leiten Sie die Spuren auf den Bildern des IBA1-Kanals. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Messen festlegen aus.
Überprüfen Sie den Bereich, den Schwerpunkt und den Umfang. Wählen Sie im Dropdown-Menü Umleiten die geöffnete Datei aus, und klicken Sie auf OK. Um den Maßstab manuell basierend auf einem auf dem Bild aufgedruckten Maßstab festzulegen, wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus. Platzieren Sie den Cursor am Rand der Skala, und zeichnen Sie beim Drücken der Umschalttaste eine Linie so nah wie möglich an den Maßstab auf dem Bild.
Wählen Sie Analysieren, Skalieren festlegen. Ein Fenster wird angezeigt. Geben Sie den richtigen bekannten Abstand und die richtige Längeneinheit ein, um die Pixel pro Längeneinheit zu bestimmen, und klicken Sie auf OK. Um die Soma-Größe im IBA1-Kanal zu messen, zeichnen Sie mit dem Werkzeug Freihandauswahl einen groben Umfang des Soma.
Doppelklicken Sie auf das Oval-Werkzeug auf der Symbolleiste, um das Auswahlpinsel-Werkzeug zu aktivieren. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Auswahlpinsel aktivieren aktiviert ist, und klicken Sie auf OK. Passen Sie mit dem Auswahlpinsel die Ablaufverfolgung so an, dass sie am besten zum Soma passt. Durch das Zoomen wird die Genauigkeit in diesem Schritt ermöglicht.
Drücken Sie als Nächstes die T-Taste, um die Soma-Ablaufverfolgung zum ROI-Manager hinzuzufügen. Wählen Sie Analysieren, Messen oder drücken Sie die M-Taste, um die Ergebnisse anzuzeigen. Kopieren Sie diese Ergebnisse, und fügen Sie sie in ein Datenblatt ein.
Wechseln Sie zum Fenster ROI-Manager, wählen Sie den interessenreichen Bereich aus, und ändern Sie den Namen, um dem Namen des Bildes zu entsprechen, indem Sie auf Umbenennen klicken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die umbenannte Interessensregion und klicken Sie auf Speichern. Stellen Sie sicher, dass der Name angibt, dass die Ablaufverfolgung für soma ist, und speichern Sie die Datei.
Um den Arborisierungsbereich im IBA1-Kanal zu messen, wählen Sie zuerst das Werkzeug Polygonauswahl aus. Klicken Sie mit dem Werkzeug auf die mikrogliaale Prozessextremität, um die Polygonform zu starten. Gehen Sie um die Mikroglia, indem Sie auf die Spitzen jeder Prozessextremität klicken, um ein Polygon zu bilden, das am besten die Fläche darstellt, die von den mikrogliaalen Arborisationen bedeckt wird.
Wenn das Polygon abgeschlossen ist, klicken Sie auf den Startpunkt, um es zu schließen. Drücken Sie dann die T-Taste, um die Ablaufverfolgung zum ROI Manager hinzuzufügen. Wählen Sie Analysieren, Messen oder drücken Sie die M-Taste, um die Daten zum Ergebnisfenster hinzuzufügen.
Kopieren Sie diese Daten, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Um die Informationen zum Arborisierungsbereich zu speichern, wechseln Sie zum Fenster ROI Manager, wählen Sie den Interessenbereich aus, und ändern Sie den Namen, um dem Namen des Bildes zu entsprechen, indem Sie umbenennen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die umbenannte Interessensregion und klicken Sie auf Speichern.
Stellen Sie sicher, dass der Name angibt, dass die Ablaufverfolgung für die Arborisierung bestimmt ist, und speichern Sie die Datei. Diese Studie beschrieb den schrittweisen Arbeitsablauf für die immunfluoreszierende Co-Färbung von IBA1 und TMEM119 sowie für die Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um die Co-Kennzeichnung von Mikroglia mit IBA1 und TMEM119 im koronalen Abschnitt des dorsalen Hippocampus bei 20-facher Vergrößerung abzubilden.
Eine erfolgreiche Färbung zeigt mikrogliaale Zellkörper und ihre feinen Prozesse. Die Färbung ermöglicht die Bestimmung der mikrogliaalen Dichte und Verteilung sowie die Identifizierung von mikrogliaalen Clustern und infiltrierenden Makrophagen. Konfokale Mikroskopie wird verwendet, um die schrittweise mikrogliale Arborisation Stoltoisationsverfolgung bei 40-facher Vergrößerung abzubilden.
Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen IBA1 positive und TMEM119 positive Mikroglia sowie ein Beispiel für die Zellkörperverfolgung. Es ist wichtig, beim Zählen von Zellen konsistent zu sein und sowohl auf die Signale von IBA1 als auch auf TMEM119 zu achten. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, Regionen des Gehirns zu identifizieren, die von einem bestimmten Reiz beeinflusst werden, der dann mit komplementären Techniken eingehender untersucht werden kann.
