Bu protokol, mikroglialeke nasıl, kantitatif yoğunluk ve morfoloji analizi gerçekleştirmek yanı sıra beyne makrofaj infiltrasyon ölçmek için nasıl gösterecektir. Bu teknik, araştırmacının mikroglia dağılımı ve morfolojisindeki değişiklikleri nicel bir şekilde ölçmesine ve mikroglianın makrofajlardan ayırt edilmesine olanak sağlar Bu analiz protokolü, anti-IBA1 ve anti-TMEM119 antikorlarının mevcut olduğu mikroglial dağılım ve morfolojideki değişiklikleri ölçmek için diğer hayvan modellerine kolayca uygulanabilir. Hücre sayımlarının ve izlerinin deneysel duruma göre izlenmesi ve bu işlemin gerçekleştirilme şeklinde tutarlı olması tavsiye edilir.
Bu yordamı başlatmak için, en yakın komşu mesafesi eklentisi yüklü olan Fiji veya ImageJ gibi bir görüntü işleme programı açın. Ölçek dosyanın meta verilerinde yer alan ve meta verilerden otomatik olarak ayarlanamazsa 20X görüntüyü açın. Menü çubuğunda Analiz et, Ölçeği Ayarla'yı seçin ve ardından doğru bilgileri girin.
Görüntüyü nislinüzerine basılmış bir skalaya göre ölçeği el ile ayarlamak için Düz Çizgi aracını seçin. İmleci ölçeğin kenarına yerleştirin ve Shift tuşuna basarken görüntüdeki ölçeğe mümkün olduğunca yakın bir çizgi çizin. Analiz et, ölçek ayarla'yı seçin.
Bir pencere açılır ve pikselin uzunluk birimi başına belirlemek için bilinen doğru mesafeyi ve uzunluk birimini koyar ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, tüm kanalların bileşik görüntüsünü oluşturmak için Resim, Renk, Bileşik Oluştur'u seçin. Menü çubuğunda Analiz et, Ölçümleri Ayarla'yı seçin. Bölge, Centroid ve Çevre kontrol edin.
AçılanA Yönlendir menüsünde, Dosyayı Aç'ı seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Kanal aracını açmak için Görüntü, Renk, Kanal Aracı'na gidin. İlgi alanı etrafında kaba bir çevre çizmek için Freehand Seçimi aracını kullanın. Seçim Fırçası aracını etkinleştirmek için araç çubuğundaki Oval aracı çift tıklatın.
Seçim Fırçasını Etkinleştir kutusunun işaretlandığından emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Seçim fırçasını kullanarak, çevreyi ilgi alanına en uygun şekilde ayarlayın ve ardından y yöneticisine ok lamak için bu alan daki klavyedeki T tuşuna basın. Analiz et, Ölç veya M tuşuna bas' seçeneğini belirleyin ve Sonuçlar penceresi açılır. Sonuçları kopyalayıp bir veri sayfasına yapıştırın ve alanla ilgili bilgileri kaydedin.
İlgi alanının alanını kopyaladıktan sonra, Sonuçlar penceresindeki bilgileri üzerine tıklayarak ve Backspace tuşuna basarak temela savuruyorsunuz. YG Yöneticisi penceresini seçin, YG İzleme'yi seçin ve Yeniden Adlandır'a basarak görüntünün adını eşleşecek şekilde değiştirin. Tamam'ı tıklatın ve sonra Yatırım Getirisi İzleme'nin yeni adını sağ tıklatın ve kaydedin.
Araç çubuğundaki Fırça aracını çift tıklatın. Siyah rengi ve Fırça boyutunu 10 olarak seçin. Bindirme üzerine Paint seçeneğinin işaretsiz olduğundan emin olun.
TMEM119 kanalında, her TMEM119 pozitif mikroglia için soma'nın merkezine dikkatlice siyah bir nokta yerleştirin. TMEM119 için pozitif olmayan hücrelerin merkezine beyaz bir nokta yerleştirin. İlgi alanında bulunan tüm hücreler için aynı yordamı yineleyin.
Ardından, Görüntü, Renk, Split Channel'ı seçin, her kanal için bir pencere görüntülenir. Nokta ek açıklamaları olan kanalı tanımlayın ve diğer iki pencereyi kapatın. Yeni bölünmüş kanal görüntüsünü yeniden yönlendirmek için Analiz et, Ölçümleri Ayarla'ya gidin.
Yeniden Yönlendir menüsünde, Kanal Görüntüsünü Böl'ü seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından Resim, Tür, sekiz bit'i seçin. Görüntü Ayarla'ya gidin ve Eşik'i seçin. Her iki çubukta da kaydırıcıları sola doğru ayarlayın.
Bu şimdi beyaz görünecektir sadece siyah nokta bırakacaktır. YG Yöneticisi penceresinde ilgi çekici bölgeyi seçin. Menü çubuğunda, Parçacığı Analiz Et, Analiz Et'i seçin.
Boyut metin kutusunda, 1'den 20'ye kadar giriş. Piksel birimlerinin kutusu işaretsiz kalırken, Görüntü sonuçları, Özetle ve Yöneticiye Ekle kutusu işaretlenmelidir. Puan sayısını verecek Özet penceresini görüntülemek için Tamam'ı tıklatın.
Bu bilgileri kopyalayın ve veri sayfasına yapıştırın. Ardından, NND penceresini göstermek için eklentiler NND'yi seçin. Her sayı, her mikroglianın en yakın komşu mikrogliaya olan uzaklığı temsil eder.
Tüm bu bilgileri veri sayfasına kopyalayıp yapıştırın. Eşik penceresine geri dön ve üst kaydırıcıyı sağa doğru ayarlayın, bu da tüm beyaz noktalarını görünür bırakarak şimdi beyaz görünmesini sağlar. Parçacıkları Analiz Et penceresini görüntülemek için Analiz Et, Parçacığı Analiz Et'i seçin.
Puan sayısını sağlayan Özet penceresini göstermek için Tamam'ı tıklatın. Bu bilgileri kopyalayın ve veri sayfasına yapıştırın. Yatırım Getirisi Yöneticisi'ne gidin ve tüm noktaları seçin.
Ardından sağ tıklayın ve resmin adı ile kaydedin. Bu, bir ZIP dosyasındaki tüm noktaların kaydedilmesine olanak sağlar. İlk olarak, 4DX resim dosyalarını açın.
Görüntülerin yığında açılıp açılmaması gerektiğini soran bir açılır pencere görüntülenir. Tamam'ı tıklatın. Ardından, Z Projeksiyon penceresini açmak için Resim, Yığınlar, ZProject'i seçin. İlk dilimden son dilime kadar olan tüm dilimleri ekleyin.
Maksimum Yoğunluğun Projeksiyon Türü altında seçildiğinden emin olun ve Tamam'ı tıklatın. ZProject içeren yeni pencereyi tıklatın. Görüntü, Renkler, Split Kanalları seçin ve IBA1 kanalının görüntülerindeki izleri iletin. Menü çubuğunda, Ölçümleri Ayarla'yı seçin.
Bölgeyi, Centroid'i ve Çevreyi kontrol edin. Yeniden Yönlendir menüsünde, dosyayı açın ve Tamam'ı tıklatın. Görüntüyü nislinüzerine basılmış bir skalaya göre ölçeği el ile ayarlamak için Düz Çizgi aracını seçin. İmleci ölçeğin kenarına yerleştirin ve Shift tuşuna basarken görüntüdeki ölçeğe mümkün olduğunca yakın bir çizgi çizin.
Analiz et, ölçek ayarla'yı seçin. Bir pencere açılır. Uzunluk birimi başına Pikselleri belirlemek için bilinen doğru mesafeyi ve uzunluk birimini girdiniz ve Tamam'ı tıklatın. IBA1 kanalındaki soma boyutunu ölçmek için Freehand Selection aracıyla soma'nın kaba bir çevresini çizin.
Seçim Fırçası aracını etkinleştirmek için araç çubuğundaki Oval aracı çift tıklatın. Seçim Fırçasını Etkinleştir kutusunun işaretlandığından emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Seçim Fırçası'nı kullanarak, soma'ya en iyi uyacak şekilde izlemeyi ayarlayın. Yakınlaştırma, bu adım sırasında hassasiyet sağlar.
Ardından, Soma izini YG Yöneticisi'ne eklemek için T tuşuna basın. Sonuçları görüntülemek için Analiz Et, Ölç veya M tuşuna bas' seçeneğini belirleyin. Bu sonuçları kopyalayın ve bir veri sayfasına yapıştırın.
YG Yöneticisi penceresine gidin, ilgi çekici bölgeyi seçin ve Yeniden Adlandır'a basarak görüntünün adını eşleşecek şekilde değiştirin. Yeniden adlandırılmış ilgi alanı bölgesine sağ tıklayın ve Kaydet'i tıklatın. Adın izlemenin soma için olduğunu belirttiğinden emin olun ve dosyayı kaydedin.
IBA1 kanalındaki ağaçlandırma alanını ölçmek için önce Çokgen Seçimi aracını seçin. Çokgen şeklini başlatmak için aracı ile mikroglial proses ekstremite tıklayın. Mikroglia etrafında en iyi mikroglial arborizations tarafından kapsanan alanı temsil eden bir poligon oluşturmak için her süreç ekstremite uçlarını tıklayarak gidin.
Çokgen tamamlandığında, kapatmak için başlangıç noktasına tıklayın. Ardından, İzlemeyi YG Yöneticisi'ne eklemek için T tuşuna basın. Sonuçları Pencereye veri eklemek için Analiz Et, Ölç veya M tuşuna basın.
Bu verileri kopyalayın ve veri sayfasına yapıştırın. Ağaçlandırma alanıyla ilgili bilgileri kaydetmek için YG Yöneticisi penceresine gidin, ilgi alanını seçin ve Yeniden Adlandır'a basarak görüntünün adını eşleşecek şekilde değiştirin. Yeniden adlandırılmış ilgi alanı bölgesine sağ tıklayın ve Kaydet'i tıklatın.
Adın izlemenin ağaçlandırma için olduğunu belirttiğinden emin olun ve dosyayı kaydedin. Bu çalışmada, IBA1 ve TMEM119 immünofloresan co-boyama ve mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonu analizi için adım adım iş akışı açıklanmıştır. Floresan mikroskobu, 20X büyütmede dorsal hipokampusun koronal bölümünde IBA1 ve TMEM119 kullanılarak mikroglianın ortak etiketlemesini görüntülemek için kullanılır.
Başarılı bir boyama mikroglial hücre organları ve ince süreçleri ortaya koymaktadır. Boyama mikroglial yoğunluk ve dağılım belirlenmesi ve mikroglial kümelerin belirlenmesi ve makrofajlar infiltrasyon için izin verir. Konfokal mikroskopi 40X büyütme de adım adım mikroglial arborization izleme prosedürü görüntü için kullanılır.
Bu temsili sonuçlar IBA1 pozitif ve TMEM119 pozitif mikroglia yanı sıra hücre vücut izleme bir örnek göstermektedir. Hücreleri sayarken tutarlı olmak ve IBA1 ve TMEM119'un her iki sinyaline de dikkat etmek önemlidir. Bu teknik, araştırmacının beynin belirli bir uyarıcıdan etkilenen bölgelerini belirlemesine olanak tanır ve bu da daha sonra tamamlayıcı tekniklerle daha derinlemesine incelenebilir.
