Ex Vivo 加压希马卡毛细管- 功能研究准备

我们的方法允许研究位于结构中的血管，否则很难在Vivvo中成像，如海马。由于血管从脑组织中去除，因此可以研究毛细血管和动脉之间的信号，而不会对周围组织产生非靶效应。要分离海马，请使用小型解剖剪刀沿鼠标头部顶部的中线切割皮肤，然后将皮肤移到两侧。

从头骨的头骨侧开始，沿着中线切割头骨，直到到达嗅觉球，取出头骨的部分，直到大脑暴露。从靠近鼠标的鼻子开始，慢慢取出大脑，用剪刀切开嗅觉球、颅神经和脊髓。将大脑、腹侧下潜于莫天斯缓冲盐水中，置于解剖板的中心，将板置于解剖显微镜下。

握住与盘子底部平行的锋利边缘，用剃刀刀片一举将大脑沿着纵向裂缝切成两半。将一个半球放在板的中心，中线朝下，沿着横向裂缝将剃须刀刀片直推通过组织，以切除小脑和脑干。旋转半球，使中端朝上，并使用铲子将大脑保持到位。

将第二个铲的尖端插入语料库的下方，在组织下方铲取，以从海马体中去除丘脑、隔膜和下丘脑。海马现在应该像大脑后侧附近的弯曲结构一样可见。用一个铲子将大脑保持到位，用第二个铲子将海马从脑中挖出来。

然后将海马转移到一个新的解剖板，用新鲜的 MOP 溶液填充一半。对于海马动脉分离，在一个海马体的两端放置小针脚，以将海马动脉的样本固定向上。使用非常锋利的钳子，轻轻地伸展海马的小部分，以松开动脉周围的组织。

并搜索通过后海马组织，以确定外部横向动脉。当动脉被定位时，从海马体中抓住外部横向动脉，然后慢慢将其从组织中拉开，以收集动脉和毛细血管。每个海马体的动脉被单独去除。

当没有更多的容器要去除时，将样品放在冰上，丢弃剩余的海马组织。对于动脉的凝固，用一根以毛细血管结尾的分支定位和动脉，将动脉放入器官室中。小心地将管尖通过目标区域下方的动脉壁，以安装血管。

然后，小心地将容器滑到管上，直到有足够的组织来系上领带。使用12-0尼龙缝合线，使一个松散的结，将适合在血管和管，并使用半钩结，以确保领带，拉两端拧紧结，以确保动脉到管。将另一条领带固定在动脉的另一端，以密封它。

在腔室的对面，放下第二根管，直到管的点将细管端的领带固定下来。然后使用第三个管将毛细管分支固定在盖玻片上，将尖端靠近分支的末端，同时将毛细管的末端暴露在外。由于大脑微循环非常脆弱，一定要在割割过程中尽量减少血管的拉伸和处理，以确保动脉的生存。

对于压力成像分析，使用记录软件将腔室转移到光学显微镜阶段，并连接进流管和流出管到腔室进行大量处理。以每分钟四毫升的流量以 37 摄氏度的人工脑脊液开始增压，并将压力管连接到与压力传感器配对的内向泵上。将内部压力带到 20 毫米的汞，然后启动记录软件。

调整显微镜和图像设置，以实现尽可能清晰的图像。并使用边缘检测软件检查动脉在完全扩张时直径约为 15 到 30 微米。设置优化后，开始记录并增加容器内压力高达 40 毫米的汞，同时使用边缘检测软件记录动脉直径。

然后将室中大量进行 15 至 20 分钟，以洗掉 MOP 溶液。为了测试容器的可行性，在浴池中应用一微摩尔NS309溶液，动脉部分应扩张，表现出30至40%的原生感。一旦建立了动脉的基线基调，使用玻璃拉拔器在一端用细点制作黄牛，并使用钳子打破每个动脉的尖端，使感兴趣的药物可以顺利地流过尖端，每平方英寸有五磅的压力。

用感兴趣的药物填充管。将管管加载到连接到显微镜上的三轴微操纵器上。将压力喷射系统的管子连接到管，然后缓慢地将管子放入毛细管附近的浴缸中，注意不要撞到容器或腔室的任何部分。

为了刺激毛细管，将风管降到毛细管旁边的盖玻片，并在所需的喷射时间激活压力喷射系统。在刺激结束时，稍微提高管，以避免进一步的刺激。为了确认只有毛细血管受到刺激，用NS309溶液的微摩尔填充新的细管，并刺激毛细血管，如所证明的。

然后用无钙溶液沐浴制剂，获得最大的附庸。由于内皮中的钙敏感钾通道，一微摩尔NS309的沐浴应用导致动脉几乎最大扩张。然而，毛细管内皮细胞缺乏中小传导通道，不超极化，以回应激动剂，因此，刺激毛细管以NS309结束，不会引起上游动脉扩张，这表明NS309没有到达动脉，并可用作控制通过压力喷射施加在毛细管上的化合物的空间限制。

如所证明，使用海马毛细管胶质制剂，将人工脑脊液与10毫摩尔钾补充到毛细管末端，导致上游动脉扩张，与雄性小鼠和雌性小鼠的制剂之间没有不同。此外，Kir2抑制剂ML 133的加入，几乎消除了毛细管诱导动脉扩张，以响应10毫摩尔钾制剂从男性和女性小鼠。安装血塞时，限制与血管的直接相互作用，以尽量减少对血管的损害，并增加血管的生存能力。

一旦血管被分离，可以测试不同的药物化合物，或血管可以进一步处理，用于动物生物学、免疫化学或电生理学研究。