Il nostro metodo consente lo studio dei vasi sanguigni situati in strutture che altrimenti sarebbero difficili da immaginare in Vivo, come l'ippocampo. Poiché i vasi sanguigni vengono rimossi dal tessuto cerebrale, la segnalazione tra i capillari e l'arteriola può essere studiata senza effetti fuori bersaglio sul tessuto circostante. Per isolare l'ippocampo, utilizzare piccole forbici di dissezione per tagliare la pelle lungo la linea mediana nella parte superiore della testa del mouse e spostare la pelle ai lati.
Partendo dal lato caudale del cranio, tagliare il cranio lungo la linea mediana fino a raggiungere i bulbi olfattivi e rimuovere porzioni del cranio fino a quando il cerebro non viene esposto. Iniziando vicino al naso del topo, rimuovere lentamente il cervello, usando le forbici per tagliare i bulbi olfattivi, i nervi cranici e il midollo spinale. Immergere il cervello, il lato ventrale verso il basso nella salina tamponata MOPS, al centro di una piastra di dissezione, e posizionare la piastra sotto un microscopio a dissezione.
Tenendo il bordo affilato parallelo al fondo del piatto, utilizzare la lama del rasoio per tagliare il cervello a metà lungo la fessura longitudinale in un colpo solo. Posizionare un emisfero al centro della piastra con la linea mediana rivolta verso il basso e spingere la lama del rasoio direttamente attraverso il tessuto lungo la fessura trasversale per rimuovere il cervelletto e il tronco encefalico. Ruotare l'emisfero in modo che il lato mediale sia rivolto verso l'alto e utilizzare una spatola per tenere il cervello in posizione.
Inserire la punta di una seconda spatola sotto il corpo calloso, raccogliendo sotto il tessuto per rimuovere il talamo, il setto e l'ipotalamo dall'ippocampo. L'ippocampo dovrebbe ora essere visibile come una struttura curva vicino al lato posteriore del cerebro. Usando una spatola per tenere il cerebro in posizione, usa la seconda spatola per raccogliere l'ippocampo dal cerebro.
Quindi trasferire gli ippocampi in una nuova piastra di dissezione, riempita circa a metà strada con una fresca soluzione di MOP. Per l'isolamento dell'arteriolo ippocampale, posizionare piccoli perni ad ogni estremità di un ippocampo per fissare il lato dell'arteria ippocampale campione verso l'alto. Utilizzando forcelle molto affilate, allungare delicatamente piccole sezioni degli ippocampi per allentare il tessuto che circonda le arteriole.
E cerca attraverso i tessuti ippocampali dorsali per identificare le arterie trasversali esterne. Quando l'arteria è stata localizzata, afferrare l'arteria trasversale esterna dall'ippocampo e allontanarla lentamente dal tessuto per raccogliere le arteriole e i capillari. L'arteria di ogni ippocampo viene rimossa separatamente.
Quando non ci sono più vasi da rimuovere, posizionare i campioni sul ghiaccio e scartare il tessuto ippocampale rimanente. Per la cannulazione delle arteriole, individuare e arteriolare con un ramo che termina con i capillari e posizionare l'arteriola in una camera d'organo. Spingere con attenzione la punta della cannula attraverso la parete dell'arteriola sotto l'area bersaglio per montare il vaso sanguigno.
Quindi, far scorrere attentamente il vaso sulla cannula fino a quando non c'è abbastanza tessuto su cui posizionare la cravatta. Utilizzare 12-0 suture di nylon per creare un nodo sciolto che si adatta al vaso sanguigno e alla cannula e utilizzare un nodo mezzo intoppo per fissare le cravatte, tirare le estremità per stringere il nodo per fissare l'arteriola alla cannula. Fissare un'altra cravatta sull'altra estremità dell'arteriola per sigillarla.
Sul lato opposto della camera, abbassare una seconda cannula fino a quando il punto della cannula fissa la cravatta all'estremità dell'arteriola. Quindi utilizzare una terza cannula per fissare il ramo capillare al coverslip, posizionando la punta vicino all'estremità del ramo, lasciando esposte le estremità dei capillari. Poiché il microcircolo cerebrale è squisitamente fragile, assicurati di ridurre al minimo lo stiramento e la movimentazione dei vasi durante la procedura di cannulazione per garantire la sopravvivenza delle arteriole.
Per l'analisi della miografia a pressione, trasferire la camera su uno stadio di microscopio luminoso con software di registrazione e collegare i tubi di afflusso e deflusso alla camera per la profusione. Iniziare la profusione con 37 gradi Celsius Liquido cerebrospinale artificiale a una portata di quattro millilitri al minuto e attaccare la cannula pressante alla pompa peristaltica abbinata a un trasduttore di pressione. Portare la pressione interna a 20 millimetri di Mercurio e avviare il software di registrazione.
Regola il microscopio e le impostazioni dell'immagine per ottenere l'immagine più chiara possibile. E utilizzare il software Edge Detection per verificare che l'arteriola sia di circa 15-30 micrometri di diametro quando è completamente dilatata. Una volta ottimizzate le impostazioni, iniziare la registrazione e aumentare la pressione intravascolare nel recipiente fino a 40 millimetri di Mercurio, registrando il diametro dell'arteriola con il software Edge Detection.
Quindi abbondante la camera per 15-20 minuti per lavare la soluzione MOP. Per testare la vitalità del recipiente, applicare una soluzione micromolare NS309 alla profusione del bagno, il segmento arteriolare deve dilatarsi, dimostrando un tono miogenico dal 30 al 40%. Una volta stabilito il tono di base per l'arteriola, utilizzare un estrattore di vetro per fare cannule con un punto fine ad un'estremità e utilizzare le forcep per rompere la punta di ogni cannula, in modo che il farmaco di interesse possa fluire senza intoppi attraverso la punta a cinque libbre di pressione per pollice quadrato.
Riempi la cannula con il farmaco di interesse. E caricare la cannula su un micromanipolatore a tre assi attaccato al microscopio. Collegare il tubo dal sistema di espulsione della pressione alla cannula e abbassare lentamente la cannula nel bagno vicino ai capillari, facendo attenzione a non colpire nessuna parte del recipiente o della camera.
Per stimolare i capillari, abbassare la cannula al coverslip appena accanto ai capillari e attivare il sistema di espulsione della pressione con il tempo di espulsione desiderato. Alla fine della stimolazione, sollevare leggermente la cannula per evitare ulteriori stimolazioni. Per confermare che venivano stimolati solo i capillari, riempire la nuova cannula con un micromolare di soluzione NS309 e stimolare i capillari come dimostrato.
Quindi ottenere la vasodilatazione massima bagnando la preparazione con la soluzione senza calcio. L'applicazione a bagno di un micromolare NS309 provoca una dilatazione quasi massima dell'arteriola a causa dei canali del potassio sensibili al calcio nell'endotelio. Le cellule endoteliali capillari, tuttavia, mancano di canali di conduttanza intermedi e piccoli e non iperpolarizzano in risposta all'agonista, di conseguenza, stimolando le estremità capillari con NS309, non causano dilatazione arteriolare a monte, questo indica che NS309 non ha raggiunto l'arteriola, e può essere utilizzato come controllo per accedere alla restrizione smoziale del composto applicato sui capillari per espulsione di pressione.
Utilizzando la preparazione dell'arteriola parenchimica capillare ippocampale come dimostrato, l'applicazione di un fluido cerebrospinale artificiale integrato con 10 millimolare potassio alle estremità capillari, si traduce in una dilatazione arteriolare a monte che non differisce tra preparati di topi maschi e femmine. Inoltre, l'aggiunta dell'inibitore kir2 ML 133, abolisce virtualmente la dilatazione arteriolare indotta capillarmente, in risposta al potassio millimolare 10 nei preparati di topi maschi e femmine. Quando si monta il vesssel sanguigno, limitare le interazioni dirette con il vaso sanguigno per ridurre al minimo il danno e aumentare la vitalità del vaso.
Una volta che il vaso sanguigno è stato isolato, diversi composti farmacologici possono essere testati o il vaso sanguigno può essere ulteriormente elaborato per studi di biologia olecolare, immunochimica o elettrofisiologia.
