Nosso método permite o estudo de vasos sanguíneos localizados em estruturas que de outra forma seriam difíceis de imaginar na Vivo, como o hipocampo. Como os vasos sanguíneos são removidos do tecido cerebral, a sinalização entre os capilares e a arteriola pode ser estudada sem efeitos fora do alvo no tecido circundante. Para isolar o hipocampo, use uma pequena tesoura de dissecção para cortar a pele ao longo da linha média na parte superior da cabeça do rato e mover a pele para os lados.
Começando pelo lado caudal do crânio, corte o crânio ao longo da linha média até que as lâmpadas olfativas sejam alcançadas e remova partes do crânio até que o cerebrum seja exposto. Começando perto do nariz do rato, remova lentamente o cérebro, usando a tesoura para cortar as lâmpadas olfativas, nervos cranianos e medula espinhal. Submergir o cérebro, lado ventral para baixo em SALina tamponada MOPS, no centro de uma placa de dissecção, e coloque a placa sob um microscópio de dissecção.
Segurando a borda afiada paralela à parte inferior do prato, use lâmina de barbear para cortar o cérebro ao meio ao longo da fissura longitudinal em um golpe. Coloque um hemisfério no centro da placa com a linha média voltada para baixo e empurre a lâmina de barbear diretamente através do tecido ao longo da fissura transversal para remover o cerebelo e o tronco cerebral. Gire o hemisfério para que o lado medial esteja voltado para cima e use uma espátula para manter o cérebro no lugar.
Insira a ponta de uma segunda espátula abaixo do caloso corpus, cavando sob o tecido para remover o tálamo, o septo e o hipotálamo do hipocampo. O hipocampo deve agora ser visível como uma estrutura curva perto do lado posterior do cerebrum. Usando uma espátula para segurar o cerebrum no lugar, use a segunda espátula para tirar o hipocampo do cerebrum.
Em seguida, transfira o hipocampi para uma nova placa de dissecção, preenchida a meio caminho com uma nova solução de MOP. Para o isolamento da artéria hipocampal, coloque pequenos pinos em cada extremidade de um hipocampo para fixar a amostra da artéria hipocampal para cima. Usando fórceps muito afiados, estique suavemente pequenas seções do hipocampo para afrouxar o tecido ao redor das artérias.
E procure através dos tecidos hipocampais dorsais para identificar as artérias transversais externas. Quando a artéria estiver localizada, pegue a artéria transversal externa do hipocampo e lentamente puxe-a para longe do tecido para coletar as artérias e capilares. A artéria de cada hipocampo é removida separadamente.
Quando não houver mais vasos a serem removidos, coloque as amostras no gelo e descarte o tecido hipocampal restante. Para a canulação das artérias, localize e arteriole com um ramo que termina com capilares e coloque a arteriola em uma câmara de órgãos. Empurre cuidadosamente a ponta da cânula através da parede da arteriola abaixo da área alvo para montar o vaso sanguíneo.
Em seguida, deslize cuidadosamente o vaso para a cânula até que haja tecido suficiente para colocar a gravata. Use suturas de nylon 12-0 para fazer um nó solto que caberá sobre o vaso sanguíneo e a cânula, e use um nó meio engate para fixar as amarras, puxe as pontas para apertar o nó para fixar a artéria na cânula. Segure outro empate na outra extremidade da arteriola para selá-la.
No lado oposto da câmara, abaixe uma segunda cânula até que o ponto da cânula abaixe a gravata na extremidade da artéria. Em seguida, use uma terceira cânula para fixar o ramo capilar no deslizamento de cobertura, colocando a ponta perto da extremidade do ramo, deixando as extremidades dos capilares expostas. Como a microcirculação cerebral é extremamente frágil, certifique-se de minimizar o alongamento e manuseio dos vasos durante o procedimento de cannulação para garantir a sobrevivência das artérias.
Para análise de mografia de pressão, transfira a câmara para um estágio de microscópio leve com software de gravação e conecte a tubulação de entrada e saída à câmara para profusão. Inicie a profusão com 37 graus Celsius Fluido cefalorraquidiano artificial a uma taxa de fluxo de quatro mililitros por minuto, e conecte a cânula de pressão à bomba peristáltica emparelhada com um transdutor de pressão. Leve a pressão interna para 20 milímetros de Mercúrio e inicie o software de gravação.
Ajuste o microscópio e as configurações de imagem para alcançar a imagem mais clara possível. E use o software de detecção de borda para verificar se a arteriola tem cerca de 15 a 30 micrômetros de diâmetro quando estiver totalmente dilatada. Uma vez que as configurações tenham sido otimizadas, inicie a gravação e aumente a pressão intravascular no vaso até 40 milímetros de Mercúrio, enquanto registra o diâmetro da arteriola com o software de detecção de borda.
Em seguida, profuse a câmara por 15 a 20 minutos para lavar a solução MOP. Para testar a viabilidade do vaso, aplicar uma solução micromolar NS309 à profusão do banho, o segmento arteriolar deve dilatar, demonstrando um tom miogênico de 30 a 40%. Uma vez estabelecido o tom de linha de base para a arteriola, use um puxador de vidro para fazer cânulas com um ponto fino em uma extremidade, e use fórceps para quebrar a ponta de cada cânula, de modo que a droga de interesse possa fluir suavemente através da ponta a cinco quilos de pressão por polegada quadrada.
Encha a cânula com a droga de interesse. E carregue a cânula em um micromanipulador de três eixos ligado ao microscópio. Conecte a tubulação do sistema de ejeção de pressão à cânula, e lentamente baixe a cânula no banho perto dos capilares, tomando cuidado para não atingir nenhuma parte do vaso ou da câmara.
Para estimular os capilares, baixe a cânula até o deslizamento ao lado dos capilares e ative o sistema de ejeção de pressão com o tempo de ejeção desejado. No final da estimulação, levante ligeiramente a cânula para evitar mais estímulos. Para confirmar que apenas os capilares estavam sendo estimulados, preencha a nova cânula com um micromolar de solução NS309 e estimule os capilares como demonstrado.
Em seguida, obtenha a vasodilatação máxima banhando a preparação com a solução livre de cálcio. A aplicação do banho de um micromolar NS309 causa uma dilatação quase máxima da arteriola devido aos canais de potássio sensíveis ao cálcio no endotélio. As células endoteliais capilares, porém, carecem de canais de condução intermediários e pequenos e não hiperpolarizam em resposta ao agonista, como resultado, estimular extremidades capilares com NS309, não causa dilatação arteriolar a montante, isso indica que o NS309 não atingiu a arteriola, podendo ser usado como controle para acessar a restrição espartacial do composto aplicado aos capillares por pressão.
Utilizando a preparação da artéria parênita capilar hipocampal como demonstrado, a aplicação de um fluido cerebrospinal artificial suplementado com 10 milimônios potássio nas extremidades capilares, resulta em uma dilatação arteriolar a montante que não difere entre as preparações de camundongos machos e fêmeas. Além disso, a adição do inibidor Kir2 ML 133, praticamente aboli a dilatação arteriolar induzida capilar, em resposta a 10 milimólars potássio em preparações de camundongos machos e fêmeas. Ao montar a vesssel sanguínea, limite interações diretas com o vaso sanguíneo para minimizar os danos e aumentar a viabilidade do vaso.
Uma vez que o vaso sanguíneo tenha sido isolado, diferentes compostos medicamentosos podem ser testados ou o vaso sanguíneo pode ser processado para estudos de biologia olecular, imunoquímica ou eletrofisiologia.
