Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung von Blutgefäßen in Strukturen, die sonst in Vivo schwer abzubilden wären, wie z. B. dem Hippocampus. Da die Blutgefäße aus dem Hirngewebe entfernt werden, kann die Signalisierung zwischen den Kapillaren und der Arteriole ohne off-target-Effekte auf das umgebende Gewebe untersucht werden. Um den Hippocampus zu isolieren, verwenden Sie eine kleine Sezierschere, um die Haut entlang der Mittellinie an der Oberseite des Mauskopfes zu schneiden und die Haut an die Seiten zu bewegen.
Beginnend an der kaudalen Seite des Schädels, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie, bis die olfaktorischen Zwiebeln erreicht sind und entfernen Sie Teile des Schädels, bis das Großhirn freigelegt wird. Beginnend in der Nähe der Nase der Maus, langsam entfernen Sie das Gehirn, mit der Schere durch die Olfaktor-Glühbirnen schneiden, Hirnnerven, und Rückenmark. Tauchen Sie das Gehirn, ventrale Seite nach unten in MOPS Gepufferte Kochlinie, in der Mitte einer Sezierplatte, und legen Sie die Platte unter einem Seziermikroskop.
Halten Sie die scharfe Kante parallel zum Boden der Schale, verwenden Sie Rasierklinge, um das Gehirn in der Hälfte entlang der Längsspalte in einem Schlag zu schneiden. Platzieren Sie eine Hemisphäre in der Mitte der Platte mit der Mittellinie nach unten und drücken Sie die Rasierklinge gerade durch das Gewebe entlang der Querspalte, um das Kleinhirn und den Hirnstamm zu entfernen. Drehen Sie die Hemisphäre so, dass die mediale Seite nach oben gerichtet ist, und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.
Setzen Sie die Spitze eines zweiten Spachtels unter dem Corpus callosum ein und schaufeln Sie unter dem Gewebe, um Thalamus, Septum und Hypothalamus aus dem Hippocampus zu entfernen. Der Hippocampus sollte nun als gekrümmte Struktur in der Nähe der hinteren Seite des Großhirns sichtbar sein. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Großhirn an Ort und Stelle zu halten, verwenden Sie den zweiten Spachtel, um den Hippocampus aus dem Großhirn zu schaufeln.
Dann den Hippocampi auf eine neue Sezierplatte übertragen, die etwa zur Hälfte mit frischer MOP-Lösung gefüllt ist. Für hippocampale Arteriole Isolierung, legen Sie kleine Stifte an jedem Ende eines Hippocampus, um die Probe Hippocampus Arterie Seite nach oben zu sichern. Mit sehr scharfen Zangen, dehnen Sie sanft kleine Abschnitte des Hippocampi, um das Gewebe um die Arteriolen zu lösen.
Und durchforsten Sie die dorsalen Hippocampusgewebe, um die äußeren Transversalarterien zu identifizieren. Wenn die Arterie gefunden wurde, greifen Sie die äußere Querarterie aus dem Hippocampus und ziehen Sie sie langsam aus dem Gewebe, um die Arteriolen und Kapillaren zu sammeln. Die Arterie aus jedem Hippocampus wird separat entfernt.
Wenn keine Gefäße mehr entfernt werden müssen, legen Sie die Proben auf Eis und entsorgen Sie das verbleibende Hippocampusgewebe. Für die Cannulation der Arteriolen, lokalisieren und Arteriole mit einem Zweig, der mit Kapillaren endet und legen Sie die Arteriole in eine Orgelkammer. Schieben Sie die Kanülenspitze vorsichtig durch die Arterienwand unterhalb des Zielbereichs, um das Blutgefäß zu montieren.
Dann schieben Sie das Gefäß vorsichtig auf die Kanüle, bis genügend Gewebe vorhanden ist, auf das sie die Krawatte legen kann. Verwenden Sie 12-0 Nylon Nähte, um einen lockeren Knoten zu machen, der über das Blutgefäß und die Kanüle passt, und verwenden Sie einen halben Hakenknoten, um die Krawatten zu sichern, ziehen Sie die Enden, um den Knoten zu ziehen, um die Arterie an der Kanüle zu sichern. Sichern Sie eine weitere Krawatte am anderen Ende der Arterie, um sie zu versiegeln.
Auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer, senken Sie eine zweite Kanüle, bis der Punkt der Kanüle die Krawatte am Ende der Arterie nistet. Verwenden Sie dann eine dritte Kanüle, um den Kapillarzweig an den Deckelzuschlag zu heften und die Spitze nahe am Ende des Asts zu platzieren, während die Enden der Kapillaren freigelegt werden. Da die Mikrozirkulation des Gehirns exquisit zerbrechlich ist, achten Sie darauf, die Dehnung und Handhabung der Gefäße während des Cannulationsverfahrens zu minimieren, um das Überleben der Arteriolen zu gewährleisten.
Für die Druckmyographieanalyse übertragen Sie die Kammer mit Aufnahmesoftware auf eine Lichtmikroskopstufe und verbinden Sie die Zu- und Abflussschläuche zur Überflutung mit der Kammer. Beginnen Sie die Profusion mit 37 Grad Celsius Künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit mit einem Durchfluss von vier Millilitern pro Minute und befestigen Sie die Druckkanüle an der peristaltischen Pumpe gepaart mit einem Druckwandler. Bringen Sie den innendruck auf 20 Millimeter Quecksilber und starten Sie die Aufnahmesoftware.
Passen Sie das Mikroskop und die Bildeinstellungen an, um ein möglichst klares Bild zu erzielen. Und verwenden Sie die Edge Detection Software, um zu überprüfen, ob die Arteriole etwa 15 bis 30 Mikrometer im Durchmesser hat, wenn sie vollständig erweitert ist. Sobald die Einstellungen optimiert wurden, beginnen Sie mit der Aufnahme und erhöhen Sie den intravaskulären Druck im Gefäß bis zu 40 Millimeter Quecksilber, während Sie den Arteriendurchmesser mit der Edge Detection Software aufzeichnen.
Dann die Kammer für 15 bis 20 Minuten überziehen, um die MOP-Lösung auszuwaschen. Um die Lebensfähigkeit des Gefäßes zu testen, wenden Sie eine Mikromolar NS309-Lösung auf die Badprofusion an, das arteriolarSegment sollte sich erweitern und einen 30 bis 40% myogenen Ton aufweisen. Sobald der Grundton für die Arterie festgelegt wurde, verwenden Sie einen Glasabzieher, um Kanülen mit einem feinen Punkt an einem Ende zu machen, und verwenden Sie Zangen, um die Spitze jeder Kanüle zu brechen, so dass das Medikament von Interesse reibungslos durch die Spitze bei fünf Pfund Druck pro Quadratzoll fließen kann.
Füllen Sie die Kanüle mit dem Medikament von Interesse. Und laden Sie die Kanüle auf einen dreiachsigen Mikromanipulator, der am Mikroskop befestigt ist. Schließen Sie die Schläuche vom Druckauswurfsystem an die Kanüle an und senken Sie die Kanüle langsam in das Bad in der Nähe der Kapillaren, wobei darauf geachtet wird, dass kein Teil des Gefäßes oder der Kammer getroffen wird.
Um die Kapillaren zu stimulieren, senken Sie die Kanüle auf den Deckelrutsch direkt neben den Kapillaren und aktivieren Sie das Druckauswurfsystem mit der gewünschten Auswurfzeit. Am Ende der Stimulation die Kanüle leicht anheben, um eine weitere Stimulation zu vermeiden. Um zu bestätigen, dass nur die Kapillaren stimuliert wurden, füllen Sie die neue Kanüle mit einem Mikromolaren der NS309-Lösung und stimulieren Sie die Kapillaren, wie gezeigt.
Dann erhalten Sie die maximale Vasodilatation, indem Sie die Zubereitung mit der Calcium-freien Lösung baden. Die Bathapplikation eines einmikromollaren NS309 verursacht eine nahezu maximale Dilatation der Artezolole aufgrund der Calcium-empfindlichen Kaliumkanäle im Endothel. Kapillaren-Endothelzellen jedoch, fehlen Zwischen- und kleine Leitfähigkeitskanäle und nicht hyperpolarisieren als Reaktion auf den Agonisten, als Ergebnis, stimulierenkapillare Enden mit NS309, verursacht keine vorgelagerte arteriolar Dilatation, dies deutet darauf hin, dass NS309 die Arteriole nicht erreicht hat, und kann als Kontrolle verwendet werden, um die räumliche Beschränkung der Verbindung auf die Kapillare durch Druckauswurf zugreifen.
Mit hilfe der hippocampalen Kapillarprävale parenchymale Arteriole-Präparation, wie gezeigt, führt die Anwendung einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit, die mit 10 Millimolaren-Kalium auf die Kapillarenenden ergänzt wird, zu einer vorgelagerten arteriolaren Dilatation, die sich nicht zwischen Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen unterscheidet. Darüber hinaus wird durch die Zugabe des Kir2-Inhibitors ML 133 die kapillarinduzierte arteriolare Dilatation als Reaktion auf 10 Millimolar Kalium in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen praktisch abgeschafft. Bei der Montage des Blutvesssels, begrenzen Sie direkte Wechselwirkungen mit dem Blutgefäß, um die Schäden zu minimieren, und erhöhen Sie die Lebensfähigkeit des Gefäßes.
Sobald das Blutgefäß isoliert ist, können verschiedene Wirkstoffverbindungen getestet oder das Blutgefäß für Olekuläre Biologie-, Immunchemie- oder elektrophysiologische Studien weiterverarbeitet werden.
