השיטה שלנו מאפשרת לחקור כלי דם הממוקמים במבנים שאחרת היה קשה לדמיין בוויבו, כגון ההיפוקמפוס. מכיוון כלי הדם מוסרים מן רקמת המוח, האיתות בין נימים העורקים ניתן ללמוד ללא השפעות מחוץ ליעד על הרקמה שמסביב. כדי לבודד את ההיפוקמפוס, השתמש מספריים ניתוח קטן לחתוך את העור לאורך קו האמצע בחלק העליון של הראש של העכבר ולהזיז את העור לצדדים.
החל בצד caudal של הגולגולת, לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע עד נורות הריח הם הגיעו ולהסיר חלקים של הגולגולת עד המוח הגדול נחשף. החל ליד האף של העכבר, לאט להסיר את המוח, באמצעות מספריים לחתוך דרך נורות הריח, עצבי הגולגולת, וחוט השדרה. להטביע את המוח, בצד הגחוני למטה ב- MOPS Buffered Saline, במרכז צלחת ניתוח, ולנחות את הצלחת תחת מיקרוסקופ ניתוח.
מחזיקים את הקצה החד במקביל לתחתית המנה, משתמשים בסכין גילוח כדי לחתוך את המוח לשניים לאורך סדק האורך במכה אחת. מניחים חצי כדור אחד במרכז הצלחת כאשר קו האמצע פונה כלפי מטה ודוחפים את סכין הגילוח ישר דרך הרקמה לאורך סדק רוחבי כדי להסיר את המוח הקטן ואת גזע המוח. סובב את חצי הכדור כך שהצד המדילי פונה כלפי מעלה ולהשתמש במתית כדי להחזיק את המוח במקומו.
הכנס את הקצה של מרית שנייה מתחת לקורפוס קאלוסום, סקופים מתחת לרקמה כדי להסיר את התלמוס, מחיצה, והיפותלמוס מן ההיפוקמפוס. ההיפוקמפוס צריך להיות גלוי כעת כמבנה מעוקל ליד הצד האחורי של המוח הגדול. באמצעות מרית אחת להחזיק את המוח הגדול במקום, להשתמש במתית השנייה כדי לגרוף את ההיפוקמפוס מתוך המוח הגדול.
ואז להעביר את ההיפוקמפוס לצלחת ניתוח חדשה, מלא בערך באמצע הדרך עם פתרון MOP טרי. לבידוד עורקים בהיפוקמפוס, מניחים סיכות קטנות בכל קצה של היפוקמפוס אחד כדי לאבטח את צד העורק ההיפוקמפוס לדוגמה למעלה. באמצעות מדפים חדים מאוד, בעדינות למתוח חלקים קטנים של ההיפוקמפוס כדי לשחרר את הרקמה המקיפה את העורקים.
ולחפש דרך רקמות ההיפוקמפוס הגבי כדי לזהות את העורקים הרוחליים החיצוניים. כאשר העורק אותר, לתפוס את העורק הרוחבים החיצוני מן ההיפוקמפוס לאט למשוך אותו מן הרקמה כדי לאסוף את העורקים נימים. העורק מכל היפוקמפוס מוסר בנפרד.
כאשר אין יותר כלי להסרה, מניחים את הדגימות על הקרח ומשליכים את רקמת ההיפוקמפוס הנותרת. עבור cannulation של arterioles, לאתר עורקים עם ענף המסתיים עם נימים למקם את העורקים לתוך תא איברים. בזהירות לדחוף את קצה cannula דרך קיר העורקים מתחת לאזור היעד לעלות על כלי הדם.
לאחר מכן, בזהירות להחליק את הכלי על cannula עד שיש מספיק רקמה שבו למקם את העניבה. השתמש 12-0 תפרים ניילון כדי להפוך קשר רופף שיתאים מעל כלי הדם ואת cannula, ולהשתמש קשר חצי תקלה כדי לאבטח את הקשרים, למשוך את הקצוות כדי להדק את הקשר כדי לאבטח את העורקים אל cannula. לאבטח עניבה נוספת בצד השני של העורקים כדי לאטום אותו.
בצד הנגדי של התא, מנמיך cannula השני עד הנקודה של cannula סיכות במורד העניבה בקצה העורקים. לאחר מכן השתמשו בקנולה שלישית כדי להצמיד את ענף נימי לכיסוי, מניחים את הקצה קרוב לקצה הענף, תוך השארת קצות נימים חשופים. כמו microcirculation המוח הוא שביר להפליא, הקפד למזער את המתיחה והטיפול של כלי הדם במהלך הליך cannulation כדי להבטיח את הישרדותם של העורקים.
לניתוח מיוגרפיה בלחץ, מעבירים את התא לשלב מיקרוסקופ אור עם תוכנת הקלטה ומחברים את צינורות הזרימה והזרימה לתא לצורך שפע. התחל את שפע עם 37 מעלות צלזיוס נוזל השדרתי מלאכותי בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה, ולצרף את קנולה לחץ למשאבה peristaltic בשילוב עם מתמר לחץ. להביא את הלחץ הפנימי ל 20 מילימטרים של מרקורי ולהתחיל את תוכנת ההקלטה.
התאימו את המיקרוסקופ ואת קביעות התמונה כדי להשיג את התמונה הברורה ביותר האפשרית. ולהשתמש בתוכנת זיהוי קצה כדי לבדוק כי העורקים הוא על 15 עד 30 מיקרומטר קוטר כאשר הוא הוסיף שליטה מלאה. לאחר ההגדרות כבר אופטימיזציה, להתחיל את ההקלטה ולהגדיל את הלחץ החוץ וסקולרי בכלי עד 40 מילימטרים של מרקורי, תוך הקלטת קוטר העורקים עם תוכנת זיהוי קצה.
לאחר מכן שפע את התא במשך 15 עד 20 דקות כדי לשטוף את פתרון MOP. כדי לבדוק את הכדאיות של כלי השיט, להחיל פתרון אחד micromolar NS309 על שפע האמבטיה, קטע העורקים צריך להתהוות, הוכחת טון 30 עד 40%myogenic. לאחר הטון הבסיסי עבור העורקים הוקמה, להשתמש מושך זכוכית כדי להפוך cannulas עם נקודה עדין בקצה אחד, ולהשתמש מטליות כדי לשבור את הקצה של כל cannula, כך התרופה של עניין יכול לזרום בצורה חלקה דרך הקצה ב 5 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע.
מלא את ה Cannula עם התרופה של עניין. ותטען את הקנולה על מיקרומניפולטור תלת-צירי המחובר למיקרוסקופ. חבר את הצינורות ממערכת פליטת הלחץ לתוך הצינורית, ולאט לאט להוריד את הצינורית לתוך האמבטיה ליד נימים, דואג לא לפגוע בכל חלק של כלי השיט או התא.
כדי לעורר את נימי, להוריד את cannula כדי coverslip ממש ליד נימים ולהפעיל את מערכת פליטת הלחץ עם זמן הפליטה הרצוי. בסוף הגירוי, להעלות את cannula מעט, כדי למנוע גירוי נוסף. כדי לאשר כי רק נימים היו להיות מגורה, למלא את הקנולה החדשה עם מיקרומולר אחד של פתרון NS309 ולעורר את נימים כפי שהוכח.
לאחר מכן להשיג את vasodilation מקסימלית על ידי רחצה את ההכנה עם פתרון ללא סידן. יישום אמבטיה של NS309 micromolar אחד גורם תאט כמעט מקסימלית של העורק עקב תעלות אשלגן רגיש סידן ב אנדותל. תאים אנדותל נימי עם זאת, חסר ערוצי מוליכות ביניים וקטנים ולא hyperpolarize בתגובה ליגון, כתוצאה מכך, מגרה קצוות נימיים עם NS309, אינו גורם תרכובת העורקים במעלה הזרם תרכובת, זה מצביע על כך NS309 לא הגיע לעורקים, והוא יכול לשמש כבקרה כדי לגשת להגבלה מרחבית של המתחם להחיל על נימים על ידי פליטת לחץ.
באמצעות הכנת עורקים נימי נימי ההיפוקמפוס כפי שהודגם, היישום של נוזל השדרתי מלאכותי בתוספת 10 מילימולר אשלגן לקצוות נימי, תוצאות תיאדול עורקים במעלה הזרם שאינו שונה בין ההכנות של עכברים זכר ונקבה. כמו כן, התוספת של מעכב Kir2 ML 133, למעשה מבטלת את תיעוב העורקים הנגרמת נימי, בתגובה 10 מילימולר אשלגן בהכנות מעכברים זכר ונקבה. בעת הרכבה של וסת הדם, להגביל אינטראקציות ישירות עם כלי הדם כדי למזער את הנזק, ולהגדיל את הכדאיות של הכלי.
לאחר כלי הדם כבר מבודד, תרכובות סמים שונות ניתן לבדוק או כלי הדם יכול להיות מעובד עוד יותר עבור ביולוגיה olecular, אימונוכימיה, או מחקרים אלקטרופיזיולוגיה.
