该协议是重要的，因为它使我们能够研究蛋白质的功能，如细胞外基质蛋白，在脑管形成或成熟的后期阶段被向上调节。此方法可用于通过使用特定的 shRNA 和相应的分析工具来敲掉 C2C12 细胞中感兴趣的任何基因。这种方法的主要优点是，我们已经产生了C2C12细胞，可以持续抑制我们感兴趣的基因，即使在成熟的 myotube。
此过程最重要的方面是保持 C2C12 细胞处于未分化状态，这意味着在常规细胞培养过程中细胞密度较低。转染前一天，在六井板中每井两毫升完整的DMEM中，每毫升种子5倍10至第四个C2C12细胞，在37摄氏度和5%CO2下过夜孵育后达到40-50%的汇合。第二天早上，将100微升25毫升氯化钠混合在一个1.5毫升的反应管中，与25.5微升PEI库存溶液（未分化的C2C12细胞培养液）在37摄氏度下孵育5分钟。
接下来，将三微克质粒DNA与100微升的25毫摩尔氯化钠每培养井相结合，在37摄氏度下孵育5分钟。在孵育结束时，将每个稀释的PEI试剂的整个体积与每个稀释的质粒溶液与温和的移液相结合，在37摄氏度下进行25分钟的孵育。在孵育过程中，用没有抗生素或血清的DMEM取代C2C12细胞培养物的超级细胞。
在孵育结束时，将每个转染混合物的整个体积添加到液滴中的每一个井中，同时持续移动细胞培养皿。在细胞培养培养箱中六小时后，用完整的DMEM替换每一个井中的培养基。转染后24小时，用每毫升紫霉素5微克的选型培养基代替每井中完整的DMEM，将细胞返回细胞培养箱10至14天，或直到观察到稳定的C2C12细胞。
然后扩大低细胞密度培养中的抗霉素C2C12细胞，每毫升紫红色素有5微克，并冷冻保存6至10小瓶细胞供将来使用。为了准备C2C12细胞进行分化，种子1.5倍10至第五稳定的耐紫霉素C2C12细胞在12井板中每井选择培养的一毫升培养基中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳中孵育，直到培养物95%汇合。为了诱导分化，在装有摄像头的倒置的亮场显微镜上，每两天用无血清 DMEM 代替每井中的介质。
对于分化细胞的霉素重链免疫，将五倍至第四个耐青霉素的C2C12细胞在500微升中，每个腔室有完整的DMEM，放在八井腔腔滑轨上，将细胞返回细胞培养箱。当细胞达到95%汇合时，用500微升无血清DMEM代替每井中的选型介质。在适当的实验时间点，每次洗涤用5毫升PBS冲洗每个井中的区分细胞三次，然后用每口PBS中4%的四甲醛的200微升固定细胞。
15分钟后，每次洗涤用新鲜PBS清洗细胞三次，然后用每井PBS中的200微升5摩尔甘氨酸孵育5分钟。在孵育结束时，在PBS中用200微升1%非离子表面活性剂渗透细胞前清洗细胞三次，10分钟。接下来，用每孔PBS中200微升5%牛血清白蛋白的200微升阻断非特异性抗体结合位点，一小时，然后用PBS进行三次洗涤。
上次洗涤后，在室温下用200微升的米奥辛重链抗体给细胞贴上两个小时的标签。三次PBS洗涤后，在室温下用适当的二级抗体孵育细胞两小时，不受光线影响。经过三次最后洗涤后，吸气 PBS，用一滴安装介质与 DAPI 和盖玻片补充安装细胞。
然后使用适当的过滤器集观察荧光显微镜上的每个腔室。为了评估西方印迹在细胞培养物中的敲击效率，第一种子在六井板中每井两毫升完整的DMEM中，将三倍10对第五个耐紫霉素的C2C12细胞。24小时后，用PBS冲洗培养物，并用两毫升无血清DMEM开始分化细胞，如证明。
为了在适当的实验时间点分析分泌的蛋白质，从每个井中收集一毫升无血清条件介质，进入单独的1.5毫升反应管中进行离心。离心后，将一毫升的调节介质中上流剂转移到新的1.5毫升反应管中，并在每管非离子表面活性剂中用391微升三氯乙酸沉淀蛋白质。30秒的涡旋后，在冰上孵育混合物10分钟。
在孵化结束时，通过离心对沉淀的蛋白质进行颗粒化，用新鲜的冰冷丙酮和每次洗涤一个离心洗涤三次。上次洗涤后，在室温下风干颗粒三至四分钟，然后每管再用 50 微升 SDS-PAGE 样品缓冲液重新储存。然后按照标准协议，在西方印迹分析之前，在95摄氏度下将样品煮沸5分钟。
对于细胞内和膜结合蛋白分析，每孔用两毫升 PBS 冲洗细胞层，并使用细胞刮刀小心地将细胞以一毫升 PBS 体积排开。将细胞转移到单独的1.5毫升管中进行离心，然后通过离心每管每管一毫升PBS中洗三次。上次洗涤后，将细胞颗粒重新在200微升的解解缓冲液中，并辅以无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂，在冰上孵育30分钟。
在孵化结束时，在冰上对样品进行超声波检测15秒，功率输出设置为10，工作频率为23千赫，通过离心去除细胞碎片。将超自然剂转移到新的1.5毫升反应管中，并根据标准方案确定蛋白质浓度。将100微克蛋白质与5X SDS-PAGE样品缓冲液混合，每个样品总体积为60微升，在95摄氏度下将样品煮沸5分钟。
然后通过西印分析样品，以寻找所需的靶蛋白。由于有效消除非耐药细胞，可于转染后10至14天内选择耐霉素C2C12细胞。通常，超过 80% 的 C2C12 细胞在此期间从细胞培养盘分离，并在日常细胞维护期间被移除。
抗纯霉素的C2C12细胞表示对照或ADAMTSL2 shRNA保持其主轴状，拉长细胞形态在低细胞密度，以及他们的能力，区分成 myotube。C2C12血清提取时分化可以通过明亮的场显微镜和免疫着色来监测肌管标记肌素重链。在分化启动后三到五天内观察到米奥辛重链阳性的 myosin 正核管，并且是多核的，如细胞边界内存在多个 DAPI 阳性核所观察到的。
正如增殖条件下的基因表达数据所示，可进行40至60%的转染检测效率，以确认从C2C12细胞中获得的敲解成功，例如，与对照shRNA表达细胞相比，稳定地表达针对ADAMTSL2的shRNA。在选择过程中，确保纯霉素浓度保持足够高，以消除所有非转染C2C12细胞，否则非转染细胞可能生长在转染细胞。这种测定使我们能够确定细胞外基质蛋白的功能，这些蛋白质在肌肉发育中后来表达，即使它们在C2C12分化后5天或10天被诱导。
请记住，RNA 萃取试剂和β-麦角乙醇应在烟罩中处理，并按照适当的安全规程处理三氯乙酸。谢谢你的收看，祝你的实验好运。
