이 프로토콜은 우리가 근관 형성 또는 성숙의 후반 단계에서 위로 조절되는 세포외 매트릭스 단백질과 같은 단백질의 기능을 연구할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 방법은 특정 shRNA 및 표화를 위한 각각의 분석 도구를 사용하여 C2C12 세포에 대한 관심있는 유전자를 노크하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 성숙한 심모튜브에서도 관심 유전자를 지속적으로 억제할 수 있는 C2C12 세포를 생성했다는 것입니다.
이 절차의 가장 중요한 양상은 일상적인 세포 배양 동안 낮은 세포 밀도를 의미하는 미분화 상태에서 C2C12 세포를 유지하는 것입니다. 전일, 5회 10~4차 C2C12 세포를 밀리리터당 2밀리리터당 6웰 플레이트에 5번 10번 시드하여 하룻밤 동안 37도, CO25%의 인큐베이션 후 40~50%의 합류를 달성합니다. 다음 해 아침, 25밀리알나트륨 100마이크로리터를 배양당 1.5밀리리터 반응튜브에 잘 결합하여 25.5 마이크로리터 PEI 스톡 용액을 37도에서 5분간 배양할 수 있습니다.
다음으로, 3마이크로그램의 플라스미드 DNA와 문화당 25밀리알라 나트륨 염화나트륨 100마이크로리터를 잘 결합하여 섭씨 37도에서 5분간 배양할 수 있습니다. 인큐베이션이 끝나면 각 희석 된 PEI 시약의 전체 부피를 각 희석 된 플라스미드 솔루션과 37 °C의 25 분 배양시 부드러운 파이펫팅을 결합합니다. 인큐베이션 동안, C2C12 세포 배양물의 초월체를 항생제 나 혈청 없이 DMEM으로 대체한다.
인큐베이션의 끝에서, 세포 배양 접시를 지속적으로 이동하면서, 물방울에 각 잘 각 투명 믹스의 전체 볼륨을 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 6시간 후, 각 웰의 배지를 완전한 DMEM으로 교체한다. 24시간 후, 전체 DMEM을 푸오마이신의 밀리리터당 5마이크로그램으로 보충한 선택 매체로 교체하고, 세포를 10~14일 동안 또는 안정적인 C2C12 세포가 관찰될 때까지 세포 배양 배양배로 돌려보도록 한다.
그런 다음 푸오마이신의 밀리리터 당 5 마이크로그램이 존재하여 저세포 밀도 배양에서 푸오마이신 내성 C2C12 세포를 확장하고, 향후 사용을 위해 세포의 6~10개의 유리병을 냉동 보존한다. 분화를 위해 C2C12 세포를 준비하기 위해, 종자 1.5배 10~5차 안정형 푸오마이신 내성 C2C12 세포는 12웰 플레이트에서 잘 선택매체의 1밀리리터로, 배양이 95% 컨플루언물이 될 때까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양한다. 차별화를 유도하기 위해, 카메라가 장착된 반전된 밝은 필드 현미경으로 myotube 형성 후 2일마다 각각의 음으로 혈청이 없는 DMEM으로 매점을 교체한다.
분화 된 세포의 미신 중형 체인 면역 염색을 위해, 챔버 당 완전한 DMEM의 500 마이크로 리터에서 제4 puromycin 내성 C2C12 세포에 5 번 10 을 종자 8 웰 챔버 슬라이드에, 세포 배양 인큐베이터로 세포를 반환. 세포가 95%의 합류에 도달하면 각 웰의 선택 매체를 혈청이 없는 DMEM500 마이크로리터로 교체하십시오. 적절한 실험 시간 지점에서, PBS당 4%의 파라포름알데히드의 200 마이크로리터로 세포를 고정하기 전에 세척당 PBS의 5 밀리리터로 각각 3회 분화 세포를 헹구는다.
15분 후, PBS당 5-어금니 글리신 200마이크로리터를 5분간 양수한 후, 세척당 신선한 PBS로 셀을 세 번 씻는다. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 1%가 아닌 계면활성제의 200마이크로리터로 세포를 퍼메아빌화하기 전에 세포를 세 번 세척하여 10분 동안 세척한다. 다음으로, PBS에서 5%소 세럼 알부민의 200마이크로리터를 1시간 동안 PBS에 3개의 세차공으로 차단한다.
마지막 세척 후, 실온에서 2 시간 동안 미오신 무거운 사슬 항체의 200 마이크로 리터로 세포를 라벨. 3개의 PBS 세척 후에, 빛으로부터 보호되는 실온에서 2 시간 동안 적절한 이차 항체로 세포를 배양합니다. 세 번의 최종 세차 후 PBS를 흡인하고, DAPI와 커버슬립으로 보충된 마운팅 배지 1방울로 셀을 장착합니다.
그런 다음 적절한 필터 세트를 사용하여 형광 현미경에 각 챔버를 관찰한다. 서쪽 블로팅에 의한 세포 배양에서 의 녹다운 효율을 평가하기 위해, 첫 번째 종자는 6웰 플레이트에서 웰당 완전한 DMEM의 2밀리리터에서 제5 푸오마이신 내성 C2C12 세포에 3번 10번 을 한다. 24 시간 후에, PBS로 배양을 헹구고, 입증된 바와 같이 혈청없는 DMEM의 2 밀리리터로 세포의 분화를 시작합니다.
적절한 실험 시간 지점에서 분비된 단백질을 분석하기 위해 각 웰에서 원심분리를 위한 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 혈청이 없는 조건배지 1밀리리터를 수집합니다. 원심분리 후, 조건부 중형 중과소의 1밀리리터를 새로운 1.5밀리리터 반응 튜브로 옮기고, 튜브당 비이온 계면활성제에서 트리클로로아세산 391마이크로리터로 단백질을 침전시한다. 30초의 소용돌이 후에 혼합물을 얼음에 10분간 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면, 경전 단백질을 원심분리에 의해 펠릿을 펠렛을 만들고, 신선한 얼음-차가운 아세톤과 세척당 원심분리로 단백질 펠릿을 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 실내 온도에서 3 ~4 분 동안 펠릿을 공기 건조한 후 튜브 당 SDS-PAGE 샘플 버퍼 의 50 마이크로 리터에서 재서스펜션하십시오. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 서쪽 얼룩 분석 전에 섭씨 95도에서 5 분 동안 샘플을 끓입니다.
세포 내 및 막 결합 단백질 분석을 위해, 우물 당 PBS의 2 밀리리터로 각 우물에 있는 세포 층을 헹구고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 PBS의 1 밀리리터 양으로 세포를 조심스럽게 제거합니다. 원심분리를 위해 개별 1.5 밀리리터 튜브로 세포를 옮기고, 원심분리를 통해 세척당 튜브당 PBS 1밀리리터에 3개의 세척이 뒤따릅니다. 마지막 세척 후, 얼음에 30 분 동안 EDTA 무료 프로테이즈 억제제 칵테일 시약으로 보충 된 용해 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
인큐베이션이 끝나면 23킬로헤르츠의 작동 주파수에서 10의 출력 설정으로 얼음시 15초 동안 시료를 초음파처리하고 원심분리에 의해 세포 이물질을 제거합니다. 새로운 1.5 밀리 리터 반응 튜브로 슈퍼 나츠제를 전송하고 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정합니다. 100 마이크로그램의 단백질과 5X SDS-PAGE 샘플 버퍼를 샘플당 총 60마이크로리터로 결합하고, 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.
그런 다음 원하는 표적 단백질의 존재를 위해 서양 블로팅에 의해 샘플을 분석합니다. 푸오마이신 내성 C2C12 세포의 선택은 비저항성 세포의 효율적인 제거로 인해 10~14일 이내에 경질을 이룰 수 있다. 전형적으로, C2C12 세포의 80% 이상이 이 기간 동안 세포 배양 접시에서 분리되고 일상적인 세포 유지 보수 중에 제거된다.
대조군 또는 ADAMTSL2 shRNA를 발현하는 푸로마이신 내성 C2C12 세포는 낮은 세포 밀도에서 스핀들 모양의 길쭉한 세포 형태를 유지하며, 심투포로 분화하는 능력도 있다. 혈청 철수 시 C2C12 분화는 myotube 마커 myosin 무거운 사슬에 대한 밝은 필드 현미경 검사법과 면역 스테인닝에 의해 모니터링될 수 있다. Myosin 무거운 사슬 양성 심포지는 분화 개시 후에 3 5 일 사이에서 관찰되고 세포 경계 내의 하나 이상의 DAPI 양성 핵의 존재에 의해 관찰된 바와 같이 다핵화된다.
증식 조건에서 유전자 발현 데이터가 입증됨에 따라, 형질의 녹다운 효율은 40~ 60% 서양 blot 분석이 얻어진 세포 용해물에서 녹다운의 성공을 확인하기 위해 수행될 수 있으며, 예를 들어 C2C12 세포로부터 담RNA를 표적으로 하는 shRNA를 안정적으로 발현하는 세포에서 세포를 발현하는 대조군에 비해. 모든 비-전감염된 C2C12 세포를 제거하기에 충분히 높은 선택 과정 동안 푸오마이신 농도를 유지해야 하거나, 또는 비-전감염된 세포가 감염된 세포를 능가할 수 있다. 이 분석법은 C2C12 분화 후 5 일 또는 10 일 유도되더라도 근육 발달에서 나중에 발현되는 세포외 매트릭스 단백질의 기능을 결정할 수 있게 합니다.
RNA 추출 시약 및 베타-메르카토에탄올은 연기 후드에서 처리되어야 하며 적절한 안전 프로토콜에 따라 트리클로로아세트산을 처리해야 합니다. 당신의 실험과 함께 보고, 행운을 주셔서 감사합니다.
