短发夹RNA介导的基因敲低在造血干和祖细胞系体外发育的树突状细胞发育研究

树突状细胞或DC是连接先天性和适应性免疫系统的关键免疫细胞。虽然DC是异质的，但这种方法可以帮助我们了解哪些基因（包括转录因子）可以调节DC的发展。该技术提供了一种简单快捷的方法来鉴定从其祖体中控制DC发育的基因。

首先，在完整的RPMI 1640培养基中维持永生化的造血干细胞和祖细胞或iHSPCs，补充每毫升100纳克FLT3配体和一个微摩尔β雌二醇。对于慢病毒转导，将iHSPCs以每孔10至第五个细胞的密度和一毫升含有FLT3配体，β雌二醇和聚苯乙烯的密度接种12孔板。然后，在每个孔中加入携带短发夹RNA的慢病毒，感染次数为100。

接下来，将板以1100次g和37摄氏度旋转90分钟，然后在37摄氏度下孵育受感染的细胞过夜。第二天，通过将细胞收集到离心中的15毫升管中来除去聚苯乙烯，然后用含有FLT3配体和β雌二醇的新鲜完整培养基替换培养基。再过24小时，向培养基中每毫升加入6微克嘌呤霉素以选择感染的细胞。

每三天更换一次选择培养基，并保持细胞至少一周以扩增稳定转导的iHSPCs。在补充有FLT3配体和β雌二醇的完整培养基中产生并保持LacZ，Tcf4和Id2的稳定敲低iHSPCs。为了启动体外分化，将未分化的iHSPCs收集到15毫升管中并通过离心沉淀细胞。

离心后，弃去上清液并用10毫升PBS洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将细胞重悬于仅含有FLT3配体的完整培养基中，然后以每毫升10至50的密度将它们接种到12孔板中。三天后，加入一毫升含有FLT3配体的新鲜完全培养基。

再过两天后，继续通过流式细胞术分析分化细胞。对于流式细胞术分析，在板中上下移液细胞两到三次，然后将细胞收集到1.5毫升管中。离心管并弃去上清液，然后将细胞重悬于50微升的传真缓冲液中。

接下来，加入50微升抗CD16的32个杂交瘤上清液，并在冰上孵育5至10分钟。然后，将荧光染料偶联抗体直接加入细胞中，并在黑暗中的冰上孵育15分钟。孵育后，用一毫升传真缓冲液洗涤细胞并离心样品。

离心后，将细胞重悬于100微升的传真缓冲液中，并通过流式细胞术分析样品。在短发夹RNA介导的iHSPCS中LacZ，Tcf4和Id2敲低后，RTQ-PCR对敲低效率的确认表明，与LacZ敲低iHSPCs相比，Tcf4和Tcf4敲低iHSPCs的表达降低。在Id2敲低iHSPCs中观察到Id2表达的类似结果。

在培养LacZ敲低iHSPCs五天后，代表树突状细胞群的CD11c阳性细胞的频率约为95%，然而，敲低Tcf4或Id2略微降低了CD11c阳性树突状细胞的产生。对来自LacZ敲低iHSPCs的CD11c阳性树突状细胞的进一步分析显示，70%是常规树突状细胞，而22%是浆细胞样树突状细胞。Tcf4敲低iHSPCs产生的LacZ敲低控制的浆细胞样树突状细胞百分比显着降低。

相比之下，Id2敲低iHSPCs产生的常规树突状细胞百分比明显低于LacZ敲低对照，但浆细胞样树突状细胞的百分比更高。自旋感染增加了携带慢病毒的shRNA进入iHSPCs的转导效率。该技术解决了转录因子的作用，并促进了细胞因子信号转导或代谢中其他基因的研究，这些基因可能参与DC的发展。