Bu protokol önemli, çünkü miyotube oluşumunun veya olgunlaşmasının sonraki aşamalarında yukarı düzenlenmiş olan hücre dışı matriks proteinleri gibi proteinlerin işlevini incelememize olanak sağlar. Bu yöntem, c2C12 hücrelerinde ilgi herhangi bir gen yıkmak için belirli shRNA'lar ve fenotipleme için ilgili analitik araçlar kullanarak kullanılabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, olgun miyotüplerde bile ilgi genlerimizi sürekli olarak bastırabilen C2C12 hücreleri üretmiş olmamızdır.
Bu prosedürün en önemli yönü, rutin hücre kültürü sırasında düşük hücre yoğunluğu anlamına gelir farklılaşmamış durumda C2C12 hücreleri korumaktır. Transfeksiyondan bir gün önce, tohum beş kez 10 dördüncü C2C12 hücreleri mililitre başına tam DMEM iki mililitre de altı kuyu plaka içinde bir gecede kuluçka sonra 40-50% bir araya ulaşmak için 37 santigrat derece ve% 5 CO2. Ertesi sabah, kültür başına 1,5 mililitrelik reaksiyon tüpünde 100 mikrolitre 25 mililitrelik sodyum klorür ile 37 santigrat derecede beş dakikalık bir kuluçka için farklılaşmamış C2C12 hücre kültürünün 25,5 mikrolitre PEI stok çözeltisi ile birleştirin.
Daha sonra, 37 santigrat derecede beş dakikalık bir kuluçka için kültür başına 100 mikrolitre 25 milimolar sodyum klorür ile plazmid DNA üç mikrogram birleştirin. Kuluçkaların sonunda, seyreltilmiş her PEI reaktifinin tüm hacmini, seyreltilmiş plazmid çözeltisi ile 37 santigrat derecede 25 dakikalık bir kuluçka için nazik pipetleme ile birleştirin. Kuluçka sırasında C2C12 hücre kültürlerinin süpernatörlerini antibiyotik veya serum olmadan DMEM ile değiştirin.
Kuluçka sonunda, sürekli hücre kültürü çanak hareket ederken, damlacıklar her kuyuya her transfection karışımının tüm hacmiekleyin. Hücre kültürü kuluçka makinesinde altı saat kaldıktan sonra, her kuyudaki ortamı tam DMEM ile değiştirin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, her kuyudaki tam DMEM'i mililitre püromisin başına beş mikrogram la takviye edilmiş seçim ortamıyla değiştirin ve hücreleri 10 ila 14 gün boyunca veya kararlı C2C12 hücreleri gözlemlenene kadar hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Daha sonra düşük hücre yoğunluğu kültürlerde puromisin dirençli C2C12 hücrelerini puromisin mililitresi başına beş mikrogram varlığında genişletin ve gelecekte kullanılmak üzere altı ila 10 şişe hücreyi kriyokorunmuş olarak koruyun. C2C12 hücrelerini farklılaşmaya hazırlamak için, 12 kuyulu bir plakada bir mililitre lik seçim ortamında 1,5 kat 10 ila beşinci kararlı püromisin dirençli C2C12 hücreleri tohum, 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kültürler %95'e kadar inküksiyon yapın. Farklılaşmayı teşvik etmek için, her kuyudaki ortamı, kamera ile donatılmış ters parlak alan mikroskobundaki miyotube oluşumunu takip eden her iki günde bir serumsuz DMEM ile değiştirin.
Diferansiye hücrelerin miyozin ağır zincir immünostaining için, tohum beş kez 10 dördüncü puromisin dirençli C2C12 hücreleri için 500 mikrolitre tam DMEM oda başına sekiz iyi bir oda slayt üzerine, ve hücre kültür kuluçka hücre kültür kuluçka hücreleri dönmek. Hücreler %95 biraraya geldiğinde, her kuyudaki seçim ortamını 500 mikrolitre serumsuz DMEM ile değiştirin. Uygun deneysel zaman noktalarında, her kuyudaki ayırt edici hücreleri yıkama başına 5 mililitre PBS ile durulayın ve hücreleri PBS'de %4'lük paraformaldehit 200 mikrolitre ile sabitler.
15 dakika sonra, sadece beş dakika boyunca iyi başına PBS 5 molar glisin 200 mikrolitre ile kuluçka takip gösterildiği gibi yıkama başına taze PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Kuluçka sonunda, hücreleri pbs'de %1'lik iyonik olmayan yüzey aktif maddeden 200 mikrolitre ile permeabilize etmeden önce üç kez yıkayın. Daha sonra, pbs başına 200 mikrolitre 5% sığır serum albumin ile nonspesifik antikor bağlama siteleri blok bir saat pbs üç yıkar.
Son yıkamadan sonra hücreleri oda sıcaklığında iki saat boyunca 200 mikrolitre miyozin ağır zincir antikorile etiketlendirin. Üç PBS yıkandıktan sonra, hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında iki saat boyunca uygun ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Üç son yıkama sonra, PBS aspire, ve DAPI ve bir coverslip ile takviye montaj orta bir damla ile hücreleri monte.
Daha sonra uygun filtre kümesini kullanarak floresan mikroskop üzerinde her oda gözlemleyin. Batı lekeleme ile hücre kültürleri knockdown verimliliğini değerlendirmek için, ilk tohum üç kez 10 beşinci puromisin dirençli C2C12 hücreleri için tam DMEM iki mililitre de altı iyi bir plaka içinde. 24 saat sonra, PBS ile kültürleri durular ve gösterildiği gibi serumsuz DMEM iki mililitre ile hücrelerin farklılaşmasını başlatın.
Salgılanan proteinlerin uygun deneysel zaman noktalarında analizi için, santrifüj için her kuyudan bir mililitre serumsuz klimalı ortam toplayın. Santrifüjden sonra, şartlı orta süpernatanların bir mililitresini yeni 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın ve tüpler başına iyonik olmayan yüzeyaktif maddede 391 mikrolitre trikloroasetik asit ile proteinleri çökeltin. Girdap 30 saniye sonra, 10 dakika buz üzerinde karışımları kuluçka.
Kuluçka sonunda, santrifüj ile çökelmiş proteinleri pelet ve taze buz gibi aseton ve yıkama başına bir santrifüj ile üç kez protein peletleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, boru başına 50 mikrolitre SDS-PAGE numune tamponu yla yeniden süspansiyondan önce peletleri oda sıcaklığında 3-4 dakika havakurutun. Daha sonra örnekleri standart protokollere göre batı leke analizinden önce 95 derecede beş dakika kaynatın.
Hücre içi ve membrana bağlı protein analizi için, her kuyudaki hücre tabakasını her kuyuda iki mililitre PBS ile durulayın ve hücreleri bir mililitrelik PBS hacimlerinde dikkatlice çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri santrifüj için tek tek 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve ardından bir mililitre pBS'de yıkama başına üç yıkama yıkın. Son yıkamadan sonra, 200 mikrolitre likis tamponundaki hücre peletlerini, buz üzerinde 30 dakikalık bir kuluçka için EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl reaktifi ile takviye edin.
Kuluçka sonunda, 23 kilohertz bir işletim frekansında 10 bir güç çıkışı ayarı ile buz üzerinde 15 saniye boyunca örnekleri ultrasonicate ve santrifüj ile hücre enkaz kaldırın. Süpernatantları yeni 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın ve protein konsantrasyonlarını standart protokollere göre belirleyin. 100 mikrogram proteini 5X SDS-PAGE örnek tamponuyla numune başına toplam 60 mikrolitre hacimde birleştirin ve numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın.
Daha sonra istenilen hedef proteinin varlığı için batı lekeleme ile örnekleri analiz edin. Puromisin dirençli C2C12 hücrelerinin seçimi, dirençli olmayan hücrelerin etkin bir şekilde ortadan kaldırılması nedeniyle transfeksiyondan sonraki 10 ila 14 gün içinde elde edilebilir. Tipik olarak, C2C12 hücrelerinin %80'den fazlası bu süre zarfında hücre kültürü çanamından uzaklanır ve rutin hücre bakımı sırasında çıkarılır.
Kontrolü ifade eden puromisin dirençli C2C12 hücreleri veya ADAMTSL2 shRNA, mil şeklindeki, uzamış hücre morfolojilerini düşük hücre yoğunluğunda ve miyotüplere ayırt etme yeteneklerini korur. Serum çekilmesi üzerine C2C12 farklılaşması miyotube marker miyozin ağır zincir için parlak alan mikroskobu ve immünboyama ile izlenebilir. Miyozin ağır zincir pozitif miyotüpler, farklılaşma nın başlamasından üç ila beş gün sonra gözlenir ve hücre sınırları içinde birden fazla DAPI-pozitif çekirdeğin varlığı nda görüldüğü gibi multinükleated edilir.
Proliferasyon koşullarındagen ekspresyonu verilerinin gösterdiği gibi, transfeksiyonun nakavt verimi 40-60%, örneğin, C2C12 hücrelerinden elde edilen hücre lysates'inde nakavt başarısını doğrulamak için yapılabilir, örneğin SHRNA'yı hedefleyen SHRNA'yı hedefleyen SHRNA'yı kontrol eden shRNA'yı kontrol etmek için. Tüm transfected Olmayan C2C12 hücrelerini ortadan kaldırmak için yeterince yüksek seçim işlemi sırasında puromisin konsantrasyonu korumak için emin olun, ya da transfected olmayan hücreler transfected hücreleri outgrow olabilir. Bu töz bize kas gelişiminde daha sonra ifade edilen ekstrasellüler matriks proteinlerin işlevini belirlemek için izin verir, onlar C2C12 farklılaşmasından sonra beş veya 10 gün indüklenen olsa bile.
RNA ekstraksiyon reaktifi ve beta-mercaptoetanol bir duman başlık ele alınması gerektiğini unutmayın ve uygun güvenlik protokollerine göre trikloroasetik asit işlemek için. İzledin ve deneyinde iyi şanslar.
