このプロトコルは、myotube の形成または成熟の後期段階でアップレギュレートされる細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質の機能を研究できるため、重要です。この方法は、特定のshRNAと、それぞれの分析ツールを使用して、C2C12細胞の関心のある遺伝子をノックダウンするために使用することができます。この方法の主な利点は、成熟したミオチューブでも、目的の遺伝子を継続的に抑制できるC2C12細胞を生成していることです。
この手順の最も重要な局面は、C2C12細胞を未分化状態に維持することであり、これは、日常的な細胞培養中の低細胞密度を意味する。トランスフェクションの前日、6ウェルプレートの完全DMEM当たり2ミリリットル当たり1ミリリットル当たり50〜4個のC2C12細胞に種を6ウェルプレートで播種し、摂氏37度および5%CO2で一晩インキュベーションした後に40〜50%の合流を達成する。翌朝、25ミリモル塩化ナトリウム100マイクロリットルを1つの1.5ミリリットル反応チューブに1つの培養チューブに組み合わせ、未分化C2C12細胞培養液のPEIストック溶液を37°Cで5分間培養します。
次に、プラスミドDNAの3マイクログラムと15ミリモル塩化ナトリウム100マイクロリットルを組み合わせて、摂氏37度で5分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、希釈した各PEI試薬の全容を各希釈プラスミド溶液と合わせて、摂氏37度で25分間のインキュベーションを行います。インキュベーション中に、C2C12細胞培養物の上清を抗生物質や血清を使わずにDMEMに交換してください。
インキュベーションの終わりに、各トランスフェクションミックスの全容を液滴の各ウェルに加え、細胞培養皿を連続的に移動させる。培養インキュベーターで6時間後、各ウェルの培地を完全なDMEMに交換する。トランスフェクションの24時間後、各ウェルの完全なDMEMを、1ミリリットル当たり5マイクログラムのピューロマイシンを補充した選択培地に置き換え、細胞培養インキュベーターに10〜14日間、または安定したC2C12細胞が観察されるまで戻す。
次に、ピューロマイシンの1ミリリットル当たり5マイクログラムの存在下で、低細胞密度培養中のピューロマイシン耐性C2C12細胞を拡大し、将来の使用のために細胞の6〜10バイアルを凍結保存する。分化のためにC2C12細胞を調製するために、種子1.5倍10〜5番目の安定したピューロマイシン耐性C2C12細胞を12ウェルプレートで1ミリリットルの選択培地で12ウェルプレートで、培養物が95%コンフルエントになるまで摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートする。分化を誘導するには、カメラを搭載した反転した明視野顕微鏡で、ミオチューブ形成後2日ごとに無血清DMEMに各ウェルの培地を交換します。
分化した細胞のミオシン重鎖免疫染色の場合、500マイクロリットルの完全なDMEMを8ウェルチャンバースライド上に500マイクロリットルの第4のピューロマイシン耐性C2C12細胞に5回10回播種し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻す。細胞が95%の合流度に達したら、各ウェルの選択培地を500マイクロリットルの無血清DMEMに交換してください。適切な実験時点で、各ウェルの分化細胞を1回5ミリリットルのPBSで3回リンスし、細胞をPBSあたりPBSで200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで固定する。
15分後、PBSあたり5分間、200マイクロリットルの5モルグリシンをインキュベートした後、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を3回洗浄します。インキュベーションの終了時に、細胞を1%の非イオン界面活性剤の200マイクロリットルで10分間透過させる前に、細胞を3回洗浄します。次に、PBSで5%のウシ血清アルブミンの200マイクロリットルを持つ非特異的抗体結合部位を1時間ブロックし、続いてPBSで3回のスッシュを行う。
最後の洗浄後、細胞に200マイクロリットルのミオシン重鎖抗体を室温で2時間ラベル付けします。3回のPBSを洗い流した後、適切な二次抗体を用いて細胞を室温で2時間インキュベートし、光から保護する。3回の最終の打ち上げの後、PBSを吸引し、DAPIとカバースリップを添加した取り付け媒体の1滴で細胞を取り付ける。
次に、適切なフィルターセットを使用して、蛍光顕微鏡で各チャンバを観察します。ウェスタンブロッティングによる細胞培養におけるノックダウン効率を評価するために、第1シードは、6ウェルプレートで完全DMEM当たり2ミリリットルの第5のピューロマイシン耐性C2C12細胞に10回10回を科した。24時間後、PBSで培養液をリンスし、2ミリリットルの無血清DMEMで細胞の分化を開始した。
適切な実験時点で分泌されたタンパク質を解析するために、各ウェルから1ミリリットルの無血清条件培地を個々の1.5ミリリットル反応チューブに集めて遠心分離を行います。遠心分離後、調整された培地上清の1ミリリットルを新しい1.5ミリリットル反応チューブに移し、チューブあたり非イオン性界面活性剤中のトリクロロ酢酸391マイクロリットルでタンパク質を沈殿させる。30秒間の渦の後、氷上で10分間培養します。
インキュベーションの終わりに、遠心分離によって沈殿したタンパク質をペレットにし、新鮮な氷冷アセトンと1回の洗浄でタンパク質ペレットを3回洗浄する。最後の洗浄後、ペレットを室温で3~4分間空気乾燥してから、チューブ当たり50マイクロリットルのSDS-PAGEサンプルバッファーに再懸濁します。その後、標準的なプロトコルに従ってウェスタンブロット分析の前に摂氏95度で5分間サンプルを沸騰させます。
細胞内および膜結合タンパク質分析のために、各ウェルの細胞層を1井戸あたり2ミリリットルのPBSでリンスし、細胞スクレーパーを使用してPBSの1ミリリットルの体積で細胞を慎重に取り除きます。遠心分離のために個々の1.5ミリリットルのチューブに細胞を移し、続いて遠心分離を介して1回の洗浄につき1回のPBS 1ミリリットルで3回の洗浄を行う。最後の洗浄後、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル試薬を添加した200マイクロリットルのリシスバッファーで細胞ペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベーションします。
インキュベーションの終わりに、23キロヘルツの動作周波数で10の出力設定で氷上で15秒間サンプルを超音波処理し、遠心分離によって細胞の破片を除去する。上清を新しい1.5ミリリットル反応チューブに移し、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。100マイクログラムのタンパク質と5X SDS-PAGEサンプルバッファーを1サンプル当たり60マイクロリットルの合計容量で組み合わせ、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。
次に、目的の標的タンパク質の存在についてウェスタンブロッティングによりサンプルを分析します。プロマイシン耐性C2C12細胞の選択は、非耐性細胞の効率的な排除のためにトランスフェクションの10〜14日以内に達成することができる。典型的には、C2C12細胞の80%以上がこの期間中に細胞培養皿から剥離し、定期的な細胞維持の間に除去される。
コントロールまたはADAMTSL2 shRNAを発現するプロロマイシン耐性C2C12細胞は、低細胞密度でスピンドル状の細長い細胞形態を保持し、またミオチューブに分化する能力を保持します。血清離脱時のC2C12分化は、ミオチューブマーカーミオシン重鎖に対する明視野顕微鏡および免疫染色によって監視することができる。ミオシン重鎖陽性筋管は分化開始後3~5日の間に観察され、多核化され、細胞境界内に複数のDAPI陽性核が存在することによって観察される。
増殖条件下での遺伝子発現データが示すように、トランスフェクションのノックダウン効率は40〜60%ウェスタンブロット分析を行い、得られた細胞ライセートにおけるノックダウンの成功を確認することができ、例えばC2C12細胞からは、制御shRNA発現細胞と比較してADAMTSL2を標的とするshRNAを安定的に発現する。選択プロセス中に、非トランスフェクトC2C12細胞のすべてを排除するのに十分な高さの間にピューロマイシン濃度を維持するようにしてください。このアッセイにより、C2C12分化の5~10日後に誘発された場合でも、筋肉の発達の後で発現する細胞外マトリックスタンパク質の機能を決定することができます。
RNA抽出試薬とβ-メルカプトエタノールは、フームフードで処理し、適切な安全プロトコルに従ってトリクロロ酢酸を処理する必要があることを覚えておいてください。見てくれてありがとう、そしてあなたの実験で幸運。
