هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لنا بدراسة وظيفة البروتينات ، مثل بروتينات المصفوفة خارج الخلية ، التي يتم تنظيمها في مراحل لاحقة من تكوين أو نضوج ميوتوب. يمكن استخدام هذه الطريقة لإسقاط أي جين من الاهتمام في الخلايا C2C12 باستخدام shRNAs محددة والأدوات التحليلية المعنية للphenotyping. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أننا قد ولدت الخلايا C2C12 التي يمكن أن تقمع باستمرار جيناتنا ذات الاهتمام، حتى في myotubes ناضجة.
الجانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو الحفاظ على خلايا C2C12 في الحالة غير المتمايزة، مما يعني في كثافة خلايا منخفضة أثناء زراعة الخلايا الروتينية. في اليوم السابق للمعالجة، بذور خمس مرات 10 إلى الخلايا C2C12 الرابعة لكل ملليلتر في مليلتر من DMEM كاملة في بئر في لوحة ستة جيدا لتحقيق التقاء 40-50٪ بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في صباح اليوم التالي، والجمع بين 100 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم 25 ملليمولار في واحد 1.5 ملليلتر أنبوب رد فعل لكل ثقافة بشكل جيد مع 25.5 ميكرولتررس PEI حل الأسهم من غير متمايز C2C12 خلية الثقافة لمدة خمس دقائق الحضانة في 37 درجة مئوية.
المقبل، والجمع بين ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 100 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم 25 ملليمولار لكل ثقافة جيدا لاحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. في نهاية الاحتضان، والجمع بين حجم كامل من كل مُكْشف PEI المخفف مع كل محلول بلازميد مخفف مع الأنابيب اللطيفة لاحتضان لمدة 25 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة، استبدال اعمى الثقافات الخلية C2C12 مع DMEM دون المضادات الحيوية أو المصل.
في نهاية الحضانة، إضافة كامل حجم كل مزيج transfection إلى كل بئر في قطرات، في حين تتحرك باستمرار طبق ثقافة الخلية. بعد ست ساعات في الحاضنة ثقافة الخلية، استبدال المتوسطة في كل بئر مع DMEM كاملة. بعد 24 ساعة من عملية التنقّل، استبدل DMEM الكامل في كل بئر بوسيلة اختيار مكمّلة بخمس ميكروغرام لكل ملليلتر من البوريميسين، ثم أعيد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 14 يومًا أو حتى يتم ملاحظة الخلايا C2C12 المستقرة.
ثم توسيع الخلايا C2C12 مقاومة البوروميسين في الثقافات منخفضة الكثافة الخلية في وجود خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من البوروميسين، و cryopreserve 6-10 قنينات من الخلايا للاستخدام في المستقبل. لإعداد الخلايا C2C12 للتمايز، بذور 1.5 مرات 10 إلى الخامس مستقرة بوروميسين مقاومة الخلايا C2C12 في ملليلتر واحد من اختيار المتوسطة في بئر في لوحة 12-جيدا، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الثقافات هي 95٪ التقاء. للحث على التمايز، استبدل الوسيط في كل بئر بـ DMEM الخالي من المصل كل يومين بعد تشكيل ميوتوب على مجهر مقلوب ذو مجال مشرق مجهز بكاميرا.
لmyosin سلسلة الثقيلة من المناعة من الخلايا المتمايزة، والبذور خمس مرات 10 إلى الخلايا C2C12 البوروميسين المقاومة الرابعة في 500 ميكرولترات من DMEM كاملة لكل غرفة على شريحة غرفة ثمانية بئر، والعودة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية. عندما تصل الخلايا إلى 95٪ التقاء، استبدال وسيط الاختيار في كل بئر مع 500 ميكرولترات من DMEM خالية من المصل. في الوقت التجريبي المناسب، شطف الخلايا المتمايزة في كل بئر ثلاث مرات مع 5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل قبل تحديد الخلايا مع 200 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في البئر.
بعد 15 دقيقة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل كما أظهرت للتو تليها الحضانة مع 200 ميكرولترات من 5-المولار الجليسين في برنامج تلفزيوني في البئر لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات قبل permeabilizing الخلايا مع 200 microliters من 1٪ غير الأيونية السطحية في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. المقبل، كتلة مواقع ربط الأجسام المضادة غير محددة مع 200 ميكرولترات من 5٪ البوم الدم البقري في برنامج تلفزيوني في البئر لمدة ساعة واحدة تليها ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني.
بعد الغسيل الأخير، تسمية الخلايا مع 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة سلسلة الثقيلة myosin لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل ثلاثة PBS ، احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. بعد ثلاثة يغسل النهائي، وpirate برنامج تلفزيوني، وجبل الخلايا مع قطرة واحدة من المتوسط تصاعد تكمل مع DAPI و coverlip.
ثم لاحظ كل غرفة على المجهر المفلور باستخدام مجموعة التصفية المناسبة. لتقييم كفاءة الضربة القاضية في الثقافات الخلية من قبل النشاف الغربية، البذور الأولى ثلاث مرات 10 إلى الخلايا C2C12 البوروميسين المقاومة الخامسة في مليلترين من DMEM كاملة في بئر في لوحة ستة جيدا. بعد 24 ساعة، شطف الثقافات مع برنامج تلفزيوني، والشروع في تمايز الخلايا مع مليلتر اثنين من DMEM خالية من المصل كما هو موضح.
لتحليل البروتينات المفرزة في نقاط الوقت التجريبية المناسبة، جمع ملليلتر واحد من المتوسطة مكيفة خالية من المصل من كل بئر إلى أنابيب رد فعل 1.5 ملليلتر الفردية للطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، نقل ملليلتر واحد من عظمى المتوسطة المشروطة إلى أنابيب تفاعل جديدة 1.5 ملليلتر، وعجلة البروتينات مع 391 ميكرولترات من حمض ثلاثي الكلور أوسيتيك في السطح غير الأيونية لكل أنبوب. بعد 30 ثانية من دوامة، احتضان المخاليط على الجليد لمدة 10 دقائق.
في نهاية الحضانة، بيليه البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي، وغسل الكريات البروتين ثلاث مرات مع الأسيتون الجليد الباردة الطازجة وrrifugation واحد لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، الهواء الجاف الكريات لمدة ثلاث إلى أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل resuspension في 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة SDS-PAGE لكل أنبوب. ثم تغلي العينات لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية قبل تحليل البقعة الغربية وفقا للبروتوكولات القياسية.
لتحليل البروتين داخل الخلايا والغشاء، شطف طبقة الخلية في كل بئر مع مليلترين من برنامج تلفزيوني في البئر، واستخدام مكشطة الخلية لإزاحة الخلايا بعناية في وحدات التخزين ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. نقل الخلايا إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر للطرد المركزي تليها ثلاثة يغسل في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب لكل غسل عن طريق الطرد المركزي. بعد الغسيل الأخير ، resuspend الكريات الخلية في 200 ميكرولترات من عازلة تحلل تكمل مع EDTA خالية من مثبطات مثبطات كاشف كوكتيل لاحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
في نهاية الحضانة، ultrasonicate العينات لمدة 15 ثانية على الجليد مع إعداد انتاج الطاقة من 10 في تردد التشغيل من 23 كيلوهيرتز، وإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي. نقل عظمى في أنابيب رد فعل 1.5 ملليلتر جديدة, وتحديد تركيزات البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. الجمع بين 100 ميكروغرام من البروتين مع 5X SDS-PAGE عينة العازلة في حجم إجمالي 60 ميكرولتر لكل عينة، وغلي العينات لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية.
ثم تحليل العينات عن طريق النشاف الغربية لوجود البروتين المستهدف المطلوب. يمكن أن يتحقق اختيار الخلايا C2C12 مقاومة للبوروميسين في غضون 10 إلى 14 يوما من transfection بسبب القضاء على كفاءة الخلايا غير المقاومة. عادةً، أكثر من 80٪ من الخلايا C2C12 فصل من طبق ثقافة الخلية أثناء هذه الفترة الزمنية ويتم إزالتها أثناء صيانة الخلايا الروتينية.
تحتفظ خلايا C2C12 المقاومة لل Puromycin التي تعبر عن التحكم أو SHRNA ADAMTSL2 برفولوجية الخلايا الممدودة على شكل المغزل في كثافة خلايا منخفضة ، بالإضافة إلى قدرتها على التمييز في ميوتوب. C2C12 يمكن رصد تمايز على انسحاب المصل عن طريق المجهر مشرق الميدان والمناعة لسلسلة ميوسين علامة myotube الثقيلة. ويلاحظ myosin الثقيلة سلسلة إيجابية myotubes بين ثلاثة إلى خمسة أيام بعد بدء التمايز ومتعددة النوى، كما لوحظ من خلال وجود أكثر من نواة إيجابية DAPI داخل حدود الخلية.
كما تظهر بيانات التعبير الجيني في ظروف الانتشار ، فإن كفاءة الضربة القاضية لـ transfection هي 40 إلى 60٪ من تحليل البقعة الغربية يمكن إجراؤها لتأكيد نجاح الضربة القاضية في الخلايا التي تم الحصول عليها ، على سبيل المثال ، من خلايا C2C12 التي تعبر بشكل ثابت عن SHRNA التي تستهدف ADAMTSL2 مقارنة بالسيطرة على الخلايا المعبرة عن SHRNA. تأكد من الحفاظ على تركيز البوروميسين أثناء عملية الاختيار عالية بما يكفي للقضاء على جميع الخلايا C2C12 غير المُزوّرة، أو قد تتفوق الخلايا غير المُصابة بالعدوى على الخلايا المُصابة بالعدوى. هذا الفحص يسمح لنا لتحديد وظيفة من البروتينات مصفوفة خارج الخلية التي يتم التعبير عنها في وقت لاحق في تنمية العضلات, حتى لو كانت تسبب خمسة أو 10 أيام بعد التمايز C2C12.
تذكر أن مُكشف استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) و(بيتا-ميركابتاتينول) يجب أن يتم التعامل معهما في غطاء أبخرة ولمعالجة حمض ثلاثي الكلور الأوسيتيك وفقًا لبروتوكولات السلامة المناسبة. شكرا لمشاهدة ، وحظا سعيدا مع تجربتك.
