翻译核糖体亲和纯化（TRAP）以研究细胞类型特异性尺度下阿拉伯生物基塔利亚纳根发育

使用 TRAP，我们可以研究细胞分辨率的发展处理。我们使用细胞型特异性启动子来驱动标记的核糖体子单元，从那里我们可以分离多体RNA。该协议产生高质量的RNA，但数量非常有限，因此，需要专门用于超低输入的方法来可靠地生成高质量的RNA库。

TRAP 是植物研究的理想工具，因为许多发育过程依赖于细胞壁相关和机械信号通路。我们使用 TRAP研究细胞在横向根的形成中的交流。由于获得高质量的RNA证明没有我们预期的直截了当，我们希望这个分步视频指令将提高 TRAP 的适用性，并帮助推广这种强大的技术。

要对传播的同源酶线进行灭菌，将少于300微升的种子均匀地撒在12个12厘米方的培养皿上，将盘子堆放在60升干燥器上。在隔夜气体灭菌后，让气体蒸发，然后再将种子收集到50毫升的储存管中。电镀前，用0.1%的加量稀释灭菌种子，每盘获得一毫升的吸收种子混合物。

要盘片种子混合物，请使用方形 Petri 盘盖创建一个层压模板支架，用于每盘种植三排种子，并放入模板支架中放置空的阿加板。将一毫升的吸收种子均匀地分配到三排盘子上。将加工过的盘子堆放在层流中，直到种子干燥。

当种子粘在阿加的表面时，合上盖子，用微孔胶带封住每个盘子。对于具有感兴趣的剂的阿拉伯多皮根的外源性治疗，准备1.5至2厘米宽、10厘米长的纸巾条。将纸巾浸泡在10微摩尔NAA中，并使用钳子在每一排根上涂抹一条纸巾。

然后，轻轻压出任何气泡，然后从板中清空多余的液体，然后用时间标记板。在适当的实验端点，使用钳子小心地从每个板中去除纸巾条，而不分离根部，并使用手术刀片沿着拍摄根结每排切割一次，在一次确定的笔触中。使用钳子沿每行的根部轻扫，将根收集在三个捆绑包中。

将根部排空成充满液氮的50毫升管，进行冷冻。收集所有每个处理根样本后，使用管盖释放多余的液氮，以防止根部溢出。将管子放入 Doer 容器中，进行 80 摄氏度的存储。

对于组织研磨和均质化，请将棉手套戴在标准实验室手套下，并将 PMSF 添加到多体萃取缓冲液中。将组织样本清空为含有液氮的砂浆中，并使用冷却的害虫仔细研磨组织，直到所有材料都显示为白色粉末。当所有组织都磨碎时，在样品中加入五毫升多体提取缓冲液，并在缓冲液冻结前快速将冷冻组织片段与粉末混合。

混合物一旦被转移，将泥浆倒入冰上的玻璃均质器中，再使用两毫升多体萃取缓冲液冲洗砂浆和刺。手动研磨浆料，直到提取物均匀。然后，将粗根提取物倒入50毫升离心管的冰上，并处理下一个样品，如所示。

对于总RNA收集，将每个粗样品的200微升等分转移到单独的清洁、预冷、标记的微离心管中。要去除细胞壁、碎屑和大型细胞器，请将样品离心，将上清液转化为新鲜、预冷的锥形管，进行第二次离心。当管子旋转时，每样品的60微升磁GSP珠子，放入1.5毫升的管中。

将管子放在磁性支架上，以方便上一杯的去除。然后，每次洗涤时，在一毫升冷洗缓冲液中清洗珠子两次，并在每个样品的60微升洗涤缓冲液中重新悬浮珠子。离心后立即将清除的上清液放入标有 15 毫升的管中，并在每个样品中加入 60 微升洗珠。

然后，将所有样品水平放入冰桶中，进行两个小时的摇摆孵育。在孵育结束时，收集冰上磁性支架上的珠子，并将PMSF添加到剩余的多体萃取缓冲液中。丢弃超钠后，向样品中加入约五毫升多体萃取缓冲液，然后轻轻倾斜，将样品中的珠子重新悬浮。

将样品在冰上摇床上摇动 15 分钟，然后用磁铁上的新鲜洗涤缓冲液洗两次，如证明。最后一次洗涤后，将样品在一毫升的洗涤缓冲液中转移到1.5毫升的管中。并在磁性支架上收集珠子一次，去除所有上经。

然后，将管子放在冰上，直到所有样品都处理完成。为了修复实验室用品，首先，将所有设备冲洗成化学废物。在彻底冲洗每个仪器之前，用肥皂洗手砂浆、刺和均质器。

接下来，将设备放在一个热安全容器中，并在220摄氏度以上过夜烘烤材料。用洗涤剂清洁所有离心管，然后将管放在带边缘和烟罩的可 <3>起托盘上。将一毫升液体二乙基热碳酸盐和一升去硫水溶液倒入管中3至18小时。

然后，在消毒器中的管盘消毒之前，先收集溶液。在这里，显示了具有 GFP 信号的代表性植物。用碘化丙二基反染色标记细胞壁轮廓。

这些线对应于内皮的定位模式和木球杆环环。在从多体RNA获得的这些代表性测量中，大多数样本的降解程度非常小，RNA完整性值从9到10不等。在这些图形中，可以观察到成功准备的库的痕迹，尽管反应量缩小，但该过程仍突出了该程序的鲁棒性。

在生成基因组跨越数据集之前，通过定量RTPCR可以探测试验实验中的 TRAP RNA，以验证治疗成功和/或实验条件，以及组织特异性。在这项分析中，对三个对奥辛反应基因的测试证实了经过两个小时的治疗后激素诱导的成功。从测序数据中检索到的组织特异性标记基因图谱证实了细胞型特异性。

处理RNA时遵循良好的实践建议。在无菌工作台工作，使用 RNA 去除溶液清洁设备，戴上手套，并在受到污染后立即更换。一定要妥善处理和丢弃所有在手术过程中使用的有毒化学品和气体，特别是苯酚-DEPC氯气和液氮。

在奥米研究组合中，TRAP占据着重要的一席之地，并且已经被用来回答许多生物学问题，特别是在发育生物学中，TRAP具有巨大的潜力。