ティラピア湖ウイルスは、チラピアとそのハイブリッド種で高い死亡率を引き起こす新興ウイルスおよび伝染病原体である。ティラピアは多くの発展途上国の主要なタンパク質源であるため、新しいウイルス感染はティラピア養殖に大きな影響を与え、世界の食料安全保障にも大きな影響を与えます。魚の組織でウイルスを検出するための高速で正確で敏感な方法の開発は、病気のコントロールを助け、ウイルスの影響を減らします。
このビデオでは、魚のサンプル中のティラピア湖ウイルスを迅速に検出するための逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMPアッセイ)を紹介します。第2部、RNA抽出。まず、3250ミリグラムの肝臓組織を無菌1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加え、600〜1000マイクロリットルの酸グアニジニウムフェノールベース試薬を含み、均質になるまでミンチする。
遠心分離機を10,000 RCFで30秒間、上清を新しいチューブに移します。等量の95%エタノールをチューブに加え、十分に混ぜます。溶液をスピンカラムに移し、回収管に入れ、遠心分離機を10,000 RCFで30秒間転送します。
フロースルーを破棄し、列を新しいコレクション チューブに転送します。カラムに400マイクロリットルのRNA PreWashを加え、遠心分離機を10,000 RCFに30秒間加えます。フロースルーを破棄し、この手順を繰り返します。
カラムに700マイクロリットルRNAウォッシュバッファーを加え、遠心分離機を10,000 RCFに2分間加えます。その後、カラムを無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。最後に、100マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水、遠心分離機を10,000 RCFで30秒間、カラムマトリックスに溶出させます。
第3部、プライマーデザイン。PrimerExplorerバージョン4は、効率的なLAMP、またはRT-LAMPプライマーを設計するための最も一般的なバイオインフォマティクスツールで、ソフトウェアの優れたマニュアルがウェブサイト上で入手可能です。ここでは、2つの内部および2つの外部プライマーから構成される4つの特定のプライマーは、タイから生まれたTiLVのセグメント3の6つの異なる領域を認識するように設計された。
リンクがビデオに表示されているウェブサイトに入った後、PrimerExplorer V4をクリックします。TiLVのセグメント3のシーケンスを含むファイルを、GENBankアクセス番号KX631923またはティラピア湖ウイルスTV1セグメント3から取得したFASTA形式で選択し、プライマーデザインボタンをクリックします。生成ボタンをクリックすると、ソフトウェアが処理され、結果が表示されます。LAMP増幅のための配列を最適化した後、合計で、1対の外部プライマーと2組の内部プライマーを、この研究のために選択し、TiLV感染を検出した。
プライマーのこのセットをここに示します。第4部、RT-LAMPのデモンストレーション。ティラピア湖ウイルスに対するRT-LAMP特異的なマスターミックスは、以下の化学物質から構成される。
表に示す化学物質を使用してマスターミックスを準備します。22マイクロリットルのマスターミックスを無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに分配します。次に、反応管に3マイクロリットルのRNAテンプレートを加えます。
陰性のコントロールには、RNA材料の代わりに蒸留水を使用し、よく混ぜます。65°Cで60分間、摂氏80度で10分間インキュベートします。30分間のインキュベーション後、カロリーメトリック変化は目の目で視覚的に観察される。
適切な場合には、RT-LAMPアッセイの結果を確認し、1.5%アガロースゲルにゲル電気泳動を行い、100ボルト定数で40分間実行し、それによって1キロベースペアの分子サイズDNAラダーをマーカーとしてロードしてフラグメントサイズを決定します。第5部、代表的な結果と解釈。30分間のインキュベーション後、魚組織におけるTiLVの陽性増幅を示唆する穀物蛍光反応は、明らかに365ナノメートルの波長でUV光下で感染したサンプルで観察され、一方で陰性対照のサンプルは透明で、わずかに無色の溶液を有していた。
これに対応して、RT-LAMP製品の増幅はアガロースゲル電気泳動で確認され、反転DNA反復の複数の増幅の様々なサイズを示し、TiLV感染サンプルのUVランプ下にステムループ構造を形成したのに対し、負の対照の井戸にはバンドが表示されなかった。したがって、チラピア湖ウイルスの拡散を減らすために、効果的に診断方法を用いて、これらの感染した魚の即時スクリーニングは、重要な鍵の一つである。したがって、新しく開発されたRT-LAMPアッセイは、バイオセキュリティ対策の過程で適用される迅速かつ敏感な診断ツールを提供する必要があります。
このアッセイは、実験室またはオンサイト施設のいずれかで使用することができます。この方法が、ティラピア湖ウイルスの拡散の減少につながる可能性のある感染魚の個体数をスクリーニングするために実装されることを願っています。
