O vírus do lago de tilápia é um vírus emergente e patógenos contagiosos, que causam alta mortalidade na tilápia e suas espécies híbridas. Como a tilápia é a principal fonte de proteína para muitos países em desenvolvimento, a nova infecção pelo vírus tem um grande impacto na aquicultura de tilápia, e também ameaça a segurança alimentar mundial. O desenvolvimento de um método rápido, preciso e sensível para detectar o vírus no tecido dos peixes ajudará o controle da doença e reduzirá o impacto do vírus.
Neste vídeo, mostraremos a amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa, ou ensaio RT-LAMP, para detecção rápida do vírus do lago de tilápia em amostras de peixes. Parte dois, extração de RNA. Em primeiro lugar, adicione 3250 miligramas de tecido hepático em um tubo de microcentrifusidade de 1,5 mililitros estéril, contendo 600 a 1000 microliters ácido guanidinium-phenol base reagente, e picadinho até homogêneo.
Centrifugar a 10.000 RCF por 30 segundos, e transferir o supernante para um novo tubo. Adicione um volume igual de 95% de etanol ao tubo e misture bem. Transfira a solução para uma coluna de spin, colocada em um tubo de coleta, depois centrífuga a 10.000 RCF por 30 segundos.
Descarte o fluxo e transfira a coluna para um novo tubo de coleta. Adicione 400 microliters de RNA PreWash na coluna e centrífuga a 10.000 RCF por 30 segundos. Descarte o fluxo e repita esta etapa.
Adicione 700 microliter RNA Wash Buffer na coluna e centrífuga a 10.000 RCF por dois minutos. Depois, transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Finalmente, elute RNA na matriz da coluna com 100 microliter, água sem nuclease e centrífuga a 10.000 RCF por 30 segundos.
Parte três, projeto de primer. O PrimerExplorer Versão 4 é a ferramenta bioinformática mais comum para projetar primers eficientes lamp, ou RT-LAMP, nos quais bons manuais para o software estão disponíveis em seu site. Aqui, quatro primers específicos, compostos por dois primers internos e dois externos, foram projetados para reconhecer seis regiões distintas no segmento 3 de TiLV, originários da Tailândia.
Depois de entrar no site, onde o link é mostrado no vídeo, clique em PrimerExplorer V4. Escolha o arquivo contendo a sequência do segmento 3 do TiLV, em formato FASTA, recuperado do número acessado pelo GenBank, KX631923 ou vírus do lago de tilápia TV1 segmento 3, e clique no botão Primer Design. Uma vez clicando no botão Gerar, o software irá processar e os resultados aparecerão. Após a otimização das sequências para amplificação de LÂMPADAs, no total, foram selecionados um par de primers externos e dois pares de primers internos para este estudo, para detectar a infecção por TiLV.
Este conjunto de primers são mostrados aqui. Parte quatro, demonstração de RT-LAMP. A mistura mestra para RT-LAMP específica para o vírus do lago de tilápia, compreende os seguintes produtos químicos.
Prepare uma mistura mestra usando os produtos químicos mostrados na mesa. Dispense 22 microliters de mistura mestre em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Em seguida, adicione três microliters de modelo RNA no tubo de reação.
Para o controle negativo, use água destilada em vez de materiais RNA e misture bem. Incubar as reações a 65 graus Celsius por 60 minutos, seguido por 80 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação por 30 minutos, as mudanças calóricas são observadas visualmente por olhos nus.
Quando apropriado, podemos confirmar os resultados do ensaio RT-LAMP, realizando eletroforese de gel em gel de 1,5%, funcionando com uma constante de 100 Volts, por 40 minutos, pelo qual uma escada de DNA de tamanho molecular de um quilobase-par é carregada junto como um marcador para determinar o tamanho do fragmento. Parte cinco, resultados representativos e interpretação. Após a incubação por 30 minutos, a reação de fluorescência de grãos sugerindo a amplificação positiva do TiLV nos tecidos de peixe, foi obviamente observada em amostras infectadas sob luz UV a um comprimento de onda de 365 nanômetros, enquanto as de controle negativo tinham uma solução clara e ligeiramente incolor.
Correspondentemente, a amplificação dos produtos RT-LAMP foi confirmada na eletroforese do gel agarose, mostrando vários tamanhos das múltiplas amplificações de repetições de DNA invertido, formando estruturas de alça-tronco sob lâmpada UV em amostras infectadas por TiLV, enquanto nenhuma faixa foi exibida nos poços do controle negativo, onde os resultados estavam de acordo com os do RT-como lampião. Assim, para reduzir a propagação do vírus do lago de tilápia, uma triagem imediata desses peixes infectados, usando um método de diagnóstico eficaz, é uma das chaves importantes. Assim, o recém-desenvolvido ensaio RT-LAMP deve oferecer uma ferramenta de diagnóstico rápida e sensível a ser aplicada no processo de medida de biossegurança.
O ensaio pode ser usado tanto no laboratório, quanto em instalações no local. Esperamos que o método seja implementado para triagem da população de peixes infectados que possam levar à redução da propagação do vírus do lago de tilápia.
