Вирус озера Тилапия является новым вирусом и инфекционными патогенами, которые вызывают высокую смертность в тилапии и ее гибридных видах. Поскольку тилапия является основным источником белка для многих развивающихся стран, новая вирусная инфекция оказывает большое влияние на аквакультуру тилапии, а также угрожает мировой продовольственной безопасности. Разработка быстрого, точного и чувствительного метода обнаружения вируса в тканях рыб поможет борьбе с болезнью и уменьшить воздействие вируса.
В этом видео мы покажем обратную транскрипцию опосредованного изотермального усиления, или анализ RT-LAMP, для быстрого обнаружения вируса озера Тилапия в образцах рыб. Часть 2, добыча РНК. Во-первых, добавить 3250 миллиграммов ткани печени в стерильные 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, содержащие от 600 до 1000 микролитров кислоты гуанидиния фенола базовый реагент, и фарш до однородной.
Центрифуга на 10 000 RCF в течение 30 секунд, и передать супернатант в новую трубку. Добавить равный объем 95% этанола в трубку, и тщательно перемешать. Перенесите раствор в спиновую колонку, помещенную в трубку для сбора, затем центрифугу на 10 000 RCF в течение 30 секунд.
Отбросьте поток через, и передать колонку в новую трубку сбора. Добавьте 400 микролитров РНК PreWash в столбец и центрифугу при 10 000 RCF в течение 30 секунд. Отбросьте поток через, и повторить этот шаг.
Добавьте 700-микролитерный РНК Wash Buffer в столбец и центрифугу при 10 000 RCF в течение двух минут. После этого перенесите колонку в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Наконец, elute РНК в колонке матрицы с 100-микролитер, нуклеазы свободной воды, и центрифуги на 10000 RCF в течение 30 секунд.
Часть три, грунтовка дизайн. PrimerExplorer Версия 4 является наиболее распространенным инструментом биоинформатики для разработки эффективных LAMP, или RT-LAMP грунтовки, в которых хорошие руководства для программного обеспечения доступны на их сайте. Здесь, четыре конкретных грунтовки, состоящие из двух внутренних и двух внешних грунтовки, были разработаны, чтобы признать шесть различных регионов в сегменте 3 TiLV, возникла из Таиланда.
После входа на веб-сайт, где ссылка отображается в видео, нажмите на PrimerExplorer V4. Выберите файл, содержащий последовательность сегмента 3 TiLV, в формате FASTA, извлеченный из номера с доступом к GenBank, KX631923, или тилапийского озера вирус TV1 сегмент 3, а затем нажмите кнопку Primer Design. После нажатия кнопки Generate программное обеспечение будет обрабатываться, и результаты будут показываться. После оптимизации последовательностей для усиления LAMP, в общей сложности, одна пара внешних грунтовок, и две пары внутренних грунтовки, были выбраны для этого исследования, чтобы обнаружить инфекцию TiLV.
Этот набор грунтовок показан здесь. Часть 4, демонстрация RT-LAMP. Мастер-микс для RT-LAMP, специфичный для вируса озера Тилапия, состоит из следующих химических веществ.
Подготовьте мастер-микс с использованием химических веществ, показанных в таблице. Выпределите 22 микролитров мастер-микса в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Затем добавьте три микролитров шаблона РНК в реакционной трубке.
Для отрицательного контроля используйте дистиллированную воду вместо РНК-материалов и хорошо перемешайте. Инкубировать реакции при 65 градусах по Цельсию в течение 60 минут, а затем 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После инкубации в течение 30 минут, калорийные изменения визуально наблюдаются невооруженным глазом.
Там, где это уместно, мы можем подтвердить результаты анализа RT-LAMP, выполняя гель электрофорез на 1,5%агарозный гель, работает со 100-Вольт постоянной, в течение 40 минут, в результате которого одна килобаза-пара молекулярного размера ДНК Лестница загружается вместе в качестве маркера для определения размера фрагмента. Часть 5, репрезентативные результаты и толкование. После инкубации в течение 30 минут реакция флуоресценции зерна, предполагающая положительное усиление TiLV в тканях рыб, очевидно, наблюдалась в зараженных образцах под ультрафиолетовым светом на длине волны 365 нанометров, в то время как те из отрицательного контроля имели четкий и слегка бесцветный раствор.
Соответственно, усиление продуктов RT-LAMP было подтверждено на электрофорезе агарозного геля, показывая различные размеры множественных усилений перевернутых повторов ДНК, образуя структуры стволовой петли под УЛЬТРА-лампой в образцах, зараженных TiLV, в то время как в колодцах отрицательного контроля, где результаты были в соответствии с результатами анализа RT-LAMP, не было. Таким образом, чтобы уменьшить распространение вируса озера Тилапия, немедленный скрининг этих инфицированных рыб, используя эффективно диагностический метод, является одним из важных ключей. Таким образом, недавно разработанный анализ RT-LAMP должен предложить быстрый и чувствительный диагностический инструмент, который будет применяться в процессе измерения биобезопасности.
Анализ может быть использован либо в лаборатории, либо на месте объектов. Мы надеемся, что этот метод будет внедриться для проверки популяции инфицированных рыб, что может привести к сокращению распространения вируса озера Тилапия.
