Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Le virus du lac Tilapia est un virus émergent et des agents pathogènes contagieux, qui causent une mortalité élevée chez le tilapia et ses espèces hybrides. Comme le tilapia est une source principale de protéines pour de nombreux pays en développement, la nouvelle infection virale a un grand impact sur l’aquaculture du tilapia, et menace également la sécurité alimentaire mondiale. Le développement d’une méthode rapide, précise et sensible pour détecter le virus dans les tissus des poissons, aidera à la lutte contre la maladie, et de réduire l’impact du virus.

Dans cette vidéo, nous montrerons l’amplification isothermale en boucle de transcription inverse, ou essai de RT-LAMP, pour la détection rapide du virus de lac de tilapia dans des échantillons de poissons. Deuxième partie, extraction de l’ARN. Tout d’abord, ajouter 3250 milligrammes de tissu hépatique dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitres, contenant 600 à 1000 microlitres acide guanidinium-phénol réagencé, et hacher jusqu’à homogénéité.

Centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes, et transférer le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal de 95 % d’éthanol au tube et bien mélanger. Transférer la solution dans une colonne de spin, placée dans un tube de collecte, puis centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes.

Jetez le flux et transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte. Ajouter 400 microlitres d’ARN PreWash dans la colonne, et centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes. Jetez le flow-through, et répétez cette étape.

Ajouter un tampon de lavage d’ARN de 700 microlitres dans la colonne, et une centrifugeuse à 10 000 RCF pendant deux minutes. Ensuite, transférez la colonne dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Enfin, allongez l’ARN dans la matrice de colonne avec un 100 microlitres, de l’eau sans nucléase et une centrifugeuse à 10 000 RCF pendant 30 secondes.

Troisième partie, conception d’amorce. Le PrimerExplorer Version 4 est l’outil bioinformatique le plus courant pour concevoir des amorces LAMP, ou RT-LAMP efficaces, dans lesquelles de bons manuels pour le logiciel sont disponibles sur leur site Web. Ici, quatre amorces spécifiques, composées de deux amorces internes et de deux amorces externes, ont été conçues pour reconnaître six régions distinctes dans le segment 3 de TiLV, originaires de Thaïlande.

Après avoir entré sur le site Web, où le lien est affiché dans la vidéo, cliquez sur PrimerExplorer V4. Choisissez le fichier contenant la séquence du segment 3 de TiLV, en format FASTA, récupéré à partir du numéro accès GenBank, KX631923, ou tilapia lake virus TV1 segment 3, puis cliquez sur le bouton Primer Design. Une fois que vous cliquez sur le bouton Générer, le logiciel se traitera, et les résultats s’afficheront. Après avoir optimiser les séquences pour l’amplification lamp, au total, une paire d’amorces externes, et deux paires d’amorces internes, ont été sélectionnés pour cette étude, pour détecter l’infection tilv.

Cet ensemble des amorces sont montrés ici. Quatrième partie, démonstration de RT-LAMP. Le mélange principal pour RT-LAMP spécifique pour le virus du lac tilapia, comprend les produits chimiques suivants.

Préparer un mélange maître à l’aide des produits chimiques indiqués dans la table. Distribuez 22 microlitres de mélange principal dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez trois microlitres de modèle d’ARN dans le tube de réaction.

Pour le contrôle négatif, utilisez de l’eau distillée au lieu de matériaux ARN, et bien mélanger. Incuber les réactions à 65 degrés Celsius pendant 60 minutes, suivies de 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation pendant 30 minutes, les changements calorimétriques sont observés visuellement à l’œil nu.

Le cas échéant, nous pouvons confirmer les résultats de l’analyse RT-LAMP, en effectuant l’électrophorèse gel sur 1,5% gel agarose, en cours d’exécution avec une constante de 100 Volts, pendant 40 minutes, par lequel une échelle d’ADN de taille moléculaire d’un kilobase-paire est chargé le long comme un marqueur pour déterminer la taille du fragment. Cinquième partie, résultats représentatifs et interprétation. Après l’incubation pendant 30 minutes, la réaction de fluorescence de grain suggérant l’amplification positive de TiLV dans les tissus de poissons, ont été évidemment observées dans les échantillons infectés sous la lumière UV à une longueur d’onde de 365 nanomètres, alors que ceux du contrôle négatif ont eu une solution claire et légèrement incolore.

En conséquence, l’amplification des produits RT-LAMP a été confirmée sur l’électrophoresis de gel d’agarose, montrant différentes tailles des amplifications multiples des répétitions inversées d’ADN, formant des structures de tige-boucle sous la lampe UV dans les échantillons TiLV-infectés, alors qu’aucune bandes n’a été montrée dans les puits du contrôle négatif, où les résultats étaient conformément à ceux de l’essai de RT-LAMP. Ainsi, pour réduire la propagation du virus du lac tilapia, un dépistage immédiat de ces poissons infectés, en utilisant une méthode de diagnostic efficace, est l’une des clés importantes. Ainsi, le nouvel essai RT-LAMP devrait offrir un outil de diagnostic rapide et sensible à appliquer dans le processus de mesure de biosécurité.

L’essai pourrait être utilisé soit dans le laboratoire, soit sur place. Nous espérons que la méthode sera mise en œuvre pour dépister la population de poissons infectés qui pourrait conduire à la réduction de la propagation du virus du lac tilapia.