틸라피아 호수 바이러스는 틸라피아와 그 하이브리드 종에서 높은 사망률을 일으키는 신흥 바이러스및 전염성 병원체입니다. 틸라피아는 많은 개발도상국의 주요 단백질 공급원이기 때문에, 새로운 바이러스 감염은 틸라피아 양식에 큰 영향을 미치고, 또한 세계 식량 안보를 위협합니다. 물고기 조직에서 바이러스를 검출하는 빠르고 정확하며 민감한 방법의 개발은 질병 조절에 도움이되며 바이러스의 영향을 줄일 수 있습니다.
이 비디오에서는 물고기 샘플에서 틸라피아 호수 바이러스를 신속하게 검출하기 위해 역전사 루프 매개 이더스말 증폭 또는 RT-LAMP 분석방법을 보여줍니다. 2부, RNA 추출. 첫째, 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 간 조직의 3250 밀리그램을 추가, 포함 600 받는 르 1000 마이크로 리터 산 guanidinium-phenol 베이스 시약, 그리고 균질까지 다진.
원심분리기는 10, 000 RCF에서 30초 동안 새로운 튜브로 상전자를 전송합니다. 튜브에 95%에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 철저히 섞습니다. 솔루션을 스핀 컬럼으로 옮기고 수집 튜브에 배치한 다음 원심분리기를 10, 000 RCF로 30초 간 전송합니다.
흐름을 버리고 컬럼을 새 수집 튜브로 옮습니다. RNA PreWash 400 마이크로리터를 컬럼에 넣고 원심분리기를 10, 000 RCF에서 30초 간 추가합니다. 흐름을 버리고 이 단계를 반복합니다.
700 마이크로리터 RNA 워시 버퍼를 컬럼에 넣고 원심분리기를 10, 000 RCF에서 2분간 추가합니다. 그 후, 컬럼을 멸균 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기다. 마지막으로, RNA를 100 마이크로리터, 뉴클레아제 없는 물 및 원심분리기를 30초 동안 10, 000 RCF로 컬럼 매트릭스로 내다보고 있다.
3 부, 프라이머 디자인. 프라이머익스플로러 버전 4는 효율적인 LAMP 또는 RT-LAMP 프라이머를 설계하기 위한 가장 일반적인 생물정보학 도구로, 소프트웨어에 대한 좋은 매뉴얼을 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 네 개의 특정 프라이머, 두 개의 내부와 두 개의 외부 프라이머로 구성, TiLV의 세그먼트 3에서 여섯 개의 별개의 영역을 인식하도록 설계되었습니다, 태국에서 유래.
링크가 비디오에 표시되는 웹 사이트를 입력한 후 PrimerExplorer V4를 클릭합니다. TiLV의 세그먼트 3의 시퀀스를 포함하는 파일을 선택, FASTA 형식으로, GenBank 액세스 번호에서 검색, KX631923, 또는 틸라피아 호수 바이러스 TV1 세그먼트 3, 다음 프라이머 디자인 버튼을 클릭합니다. 생성 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 처리되고 결과가 표시됩니다. LAMP 증폭을 위한 서열을 최적화한 후, 총 1쌍의 외부 프라이머와 두 쌍의 내부 프라이머가 TiLV 감염을 검출하기 위해 선택되었다.
프라이머의이 세트는 여기에 표시됩니다. 4부, RT-LAMP 시연. 틸라피아 호수 바이러스에 특이적인 RT-LAMP용 마스터 믹스는 다음 화학 물질로 구성된다.
테이블에 표시된 화학 물질을 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다. 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 마스터 믹스 22 마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 반응 튜브에 RNA 템플릿의 3 마이크로 리터를 추가합니다.
음의 조절을 위해 RNA 재료 대신 증류수를 사용하고 잘 섞습니다. 60분 동안 65도의 반응에 따라 10분 동안 섭씨 80도가 됩니다. 30 분 동안 잠복 후, 칼로리 변화는 육안으로 시각적으로 관찰됩니다.
적절한 경우, 우리는 1.5%의 아가로즈 겔에 겔 전기전도를 수행하여 100볼트 상수로 40분 동안 겔 전기전도를 수행하여 1킬로베이스 쌍 분자 크기의 DNA 사다리가 마커로 적재되어 단편 크기를 결정할 수 있도록 RT-LAMP 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 5부, 대표적인 결과 및 해석. 30분 동안 잠복한 후, 물고기 조직에서 TiLV의 양성 증폭을 시사하는 곡물 형광 반응은 365 나노미터의 파장에서 UV 빛 하에서 감염된 샘플에서 명백히 관찰되었으며, 음의 대조군은 명확하고 약간 무색적인 용액을 가졌다.
이에 상응하여, RT-LAMP 제품의 증폭은 아가로즈 겔 전기포고에서 확인되었으며, 반전된 DNA 반복의 다중 증폭의 다양한 크기를 나타내고, TiLV-감염된 샘플의 UV 램프 아래에 줄기 루프 구조를 형성하는 반면, 그 결과는 RT-LAMP의 결과에 따라 부정적인 대조군의 우물에 밴드가 표시되지 않았다. 따라서 틸라피아 호수 바이러스의 확산을 줄이기 위해 이러한 감염된 물고기의 즉각적인 검사는 효과적으로 진단 방법을 사용하여 중요한 열쇠 중 하나입니다. 따라서 새로 개발된 RT-LAMP 분석은 생물 보안 측정 과정에서 적용될 신속하고 민감한 진단 도구를 제공해야 합니다.
분석은 실험실 또는 현장 시설에서 사용할 수 있습니다. 우리는 틸라피아 호수 바이러스의 확산의 감소로 이어질 수있는 감염된 물고기 인구를 선별하는 방법이 구현되기를 바랍니다.
