Il virus del lago Tilapia è un virus emergente e patogeni contagiosi, che causano un'elevata mortalità nella tilapia e nelle sue specie ibride. Poiché la tilapia è una delle principali fonti proteiche per molti paesi in via di sviluppo, la nuova infezione da virus ha un grande impatto sull'acquacoltura della tilapia e minaccia anche la sicurezza alimentare mondiale. Lo sviluppo di un metodo rapido, accurato e sensibile per rilevare il virus nel tessuto ittico, aiuterà il controllo della malattia e ridurrà l'impatto del virus.
In questo video, mostreremo l'amplificazione isotermica mediata dal ciclo di trascrizione inversa, o saggio RT-LAMP, per il rilevamento rapido del virus del lago tilapia nei campioni di pesce. Seconda parte, estrazione dell'RNA. In primo luogo, aggiungere 3250 milligrammi di tessuto epatico in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri, contenente da 600 a 1000 microlitri acido guanidinium-fenolo base reagente, e tritare fino a omogeneo.
Centrifuga a 10.000 RCF per 30 secondi e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere un volume uguale di 95% di etanolo al tubo e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in una colonna di spin, posta in un tubo di raccolta, quindi centrifugare a 10.000 RCF per 30 secondi.
Scartare il flusso e trasferirlo in un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 400 microlitri di RNA PreWash nella colonna e centrifugare a 10.000 RCF per 30 secondi. Scartare il flusso e ripetere questo passaggio.
Aggiungere 700 microliter RNA Wash Buffer nella colonna e centrifugare a 10.000 RCF per due minuti. Successivamente, trasferire la colonna in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Infine, elute RNA nella matrice di colonna con un 100 microlitro, acqua senza nucleasi e centrifuga a 10.000 RCF per 30 secondi.
Parte terza, design del primer. PrimerExplorer Versione 4 è lo strumento bioinformatico più comune per la progettazione di efficienti primer LAMP, o RT-LAMP, in cui buoni manuali per il software sono disponibili sul loro sito web. Qui, quattro primer specifici, composti da due primer interni e due esterni, sono stati progettati per riconoscere sei regioni distinte nel segmento 3 di TiLV, originarie della Thailandia.
Dopo aver inserito il sito web, dove il link viene mostrato nel video, fare clic su PrimerExplorer V4. Scegliere il file contenente la sequenza del segmento 3 di TiLV, in formato FASTA, recuperato dal numero di accesso a GenBank, KX631923, o dal virus del lago Tilapia TV1 segmento 3, quindi fare clic sul pulsante Primer Design. Una volta cliccato sul pulsante Genera, il software e', e i risultati verranno mostrati. Dopo aver ottimizzato le sequenze per l'amplificazione LAMP, in totale, per questo studio sono state selezionate una coppia di primer esterni e due coppie di primer interni, per rilevare l'infezione da TiLV.
Questo set di primer è mostrato qui. Quarta parte, dimostrazione di RT-LAMP. Il master mix per RT-LAMP specifico per il virus del lago tilapia, comprende le seguenti sostanze chimiche.
Preparare una miscela master utilizzando le sostanze chimiche mostrate nella tabella. Erogare 22 microlitri di master mix in un tubo sterile a microcentrifugo da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere tre microlitri di modello di RNA nel tubo di reazione.
Per il controllo negativo, utilizzare acqua distillata invece di materiali RNA e mescolare bene. Incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per 60 minuti, seguite da 80 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione per 30 minuti, i cambiamenti calorimetrici sono osservati visivamente da occhi nudi.
Se del caso, possiamo confermare i risultati del saggio RT-LAMP, eseguendo l'elettroforesi gel su gel di agarosio all'1,5%, con una costante di 100 Volt, per 40 minuti, in base alla quale una scala del DNA a misura molecolare di una chilobase viene caricata insieme come marcatore per determinare la dimensione del frammento. Parte cinque, risultati rappresentativi e interpretazione. Dopo l'incubazione per 30 minuti, la reazione di fluorescenza del grano che suggerisce l'amplificazione positiva del TiLV nei tessuti ittici, è stata ovviamente osservata in campioni infetti sotto la luce UV ad una lunghezza d'onda di 365 nanometri, mentre quelli di controllo negativo avevano una soluzione chiara e leggermente incolore.
Di conseguenza, l'amplificazione dei prodotti RT-LAMP è stata confermata sull'elettroforesi del gel di agarosio, mostrando varie dimensioni delle amplificazioni multiple delle ripetizioni del DNA invertito, formando strutture ad anello stelo sotto lampada UV in campioni infetti da TiLV, mentre non sono state visualizzate bande nei pozzi del controllo negativo, dove i risultati erano conformi a quelli del saggio RT-LAMP. Quindi, per ridurre la diffusione del virus del lago tilapia, uno screening immediato di questi pesci infetti, usando un metodo diagnostico efficace, è una delle chiavi importanti. Pertanto, il test RT-LAMP di nuova sviluppo dovrebbe offrire uno strumento diagnostico rapido e sensibile da applicare nel processo di misura della biosicurezza.
Il saggio potrebbe essere utilizzato sia in laboratorio che in loco. Speriamo che venga implementato il metodo per migliorare la popolazione di pesci infetti che potrebbe portare alla riduzione della diffusione del virus del lago tilapia.
