酪氨酸磷酸酶SHP2是细胞信号的关键中介，促进细胞生存和增殖。我的团队专注于寻找用于治疗癌症的小分子SHP2抑制剂。我们的技术提供了一种快速而强大的方法来建立细胞的培养剂，以及小分子SHP2抑制剂在细胞中的目标接触。
这就可以保证，发现资源是高效定向的。SHP2 是癌症治疗的诱人目标。和几个SHP2抑制剂，都在临床试验中。
我们的技术，以促进发现下一代抑制剂与改进的疗效配置文件。研究助理塞莱斯特·罗梅罗和研究助理教授道格拉斯·谢夫勒将展示我们的实验室。使用三毫升细胞分离试剂，开始从板中分离 HEK293 T 细胞。
用12毫升的生长介质稀释细胞，并在1，400倍G的离心中收集细胞4分钟。将细胞味觉重新在10毫升的生长介质中，用锥板蓝色和细胞计数器测量细胞的浓度和生存能力。板70万指数级生长细胞进入六井培养板的每个井，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育24小时。
第二天，将两微克血浆DNA稀释成200微升的转染缓冲液。漩涡血浆DNA10秒，在1，400次G中，4分钟。在稀释的DNA中加入四微升转染试剂。
旋转10秒钟，重复离心。在23摄氏度下孵育DNA10分钟，然后将转染混合物加入到6个井板中附着的 HEK293 T 细胞中，并将细胞再返回到培养箱24小时。为了准备检测板，在DMSO中稀释抑制剂溶液，其库存浓度为10毫摩尔，并分配到384孔低死量源板中，立即使用。
在低于 0.5% DMSO 的目标最终体积下，使用液体处理器将所需体积的抑制剂或车辆放入 384 个实时 PCR 板中。最终体积小于 0.5%。使用带惰性气体净化的板密封器密封板。准备转染细胞孵育生长培养培养，并在37摄氏度的水浴中出售分离试剂。
从培养箱中取出细胞，轻轻地从井中吸出培养物。将 0.3 毫升的细胞分离试剂添加到每个井中，然后来回轻轻摇动板，以彻底覆盖板底的表面。在23摄氏度下孵育板两分钟。
在每个井中加入一毫升生长介质，轻轻移液井中的细胞。然后将它们转移到15毫升猎鹰离心管中离心机在1，400倍G的细胞4分钟收集细胞。轻轻吸气介质，然后将细胞颗粒重新在两毫升的生长介质中。
使用 try 泛蓝色和单元格计数器确保细胞生存能力大于 90%。稀释细胞，每微升125个细胞的浓度，保持细胞悬浮不超过两个小时，以实现最佳生存能力。对于使用SHP2抑制剂进行孵育，将细胞分配到无菌单通道溶液槽中。
将先前准备的 384 孔实时 PCR 板在 2，500 次 G 下离心 5 分钟，然后取出密封件并使用 125 微升多通道移液器，将稀释的 5 微升的电池添加到所需的孔中。在42倍G下离心30秒，不带盖子，然后盖上盖子，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板一小时。根据热轮廓梯度或等温实验的手稿方向对热循环器进行编程。
启动热循环器热脉冲程序，将检测板放在热块上。程序完成后，拆下检测板。用五微升的许可检测主混合补充检测板的每个井。
将板在42倍G下离心30秒，并在黑暗中储存在23摄氏度，30至60分钟。使用具有优化集成时间的微孔板读取器测量化学发光。野生型SHP2的热梯度实验，产生了一个西格莫德细胞热轮廓，其熔化过渡范围很窄，这是典型的折叠蛋白。
野生SHP2型与同体抑制剂SHP099的孵育，稳定到热剖面到显著和可测量的程度。SHP2 的稳定性，也跟踪与 SHP099 的功效，如同量性化合物。在10微摩尔，更强大的RMC-4550，产生比SHP099野生类型SHP2更大的稳定程度。
由于其独特的机制，SHP099像等体抑制剂对许多SHP2致癌突变体，包括SHP2-E76K效果较低。与这些已知特性一致，仅观察到SHP099的SHP2-E76K的边际热稳定性。EPL标签蛋白的表达水平可以显著影响信号强度。
用于瞬态和稳定集成野生类型细胞的热剖面。在相同的资产条件下显示。不同曲线的规范化提供了可比较的热剖面，揭示了 EFC 检测系统的广泛范围。
利用热循环器能力，在 384 井板的短轴上产生热梯度。可以在单个板上执行一系列等温滴定。在最佳温度下，使用全 10 点剂量响应的等温滴定产生一个有用的 EC50，用于 RMC-4550。
这种资产的原理可用于监测由PROTAC化合物诱导的细胞中蛋白质的降解。我们使用细胞塞尔玛移位技术来发现突变SHP2和白血病的抑制剂，针对频繁SHP2致致突变体的药物将对这些癌症的治疗产生重大影响。
