蝙蝠主要组织兼容性复杂类 I 的稳定性和结构与异质β₂- 微球蛋白

在本研究中，我们使用Bat MHC I类作为模型来总结方法，并评估与异质β-2微球蛋白复合的混合MHC I类的可行性。先前的研究表明，哺乳动物的B2M替代不会显著影响肽的表达。事实上，混合MHC类I可以激活一个类似的结构和功能，原来的分子。

这些技术可用于促进MHC I在传染病和肿瘤免疫治疗期间组织反应评估的功能和结构化研究。对于大肠杆菌培养转化添加10纳米的质粒含有蝙蝠或人类MHC类Iβ两个微球蛋白氢链到100微升均衡悬浮和沐浴在冰中30分钟。在孵化结束时，热在42摄氏度下将细菌冲击90秒，并将培养回冰浴两分钟。

接下来，在培养物中加入 800 微升的裂解肉汤，并在 37 摄氏度的摇动平台上摇动悬架 20 分钟，每分钟旋转 200 次。在孵化结束时，将100微升细菌传播到适当的抗生素耐药培养刀片上。第二天早上，挑选一个最近转化的细菌克隆，用三毫升LB用抗生素介质给克隆人接种疫苗。

将文化放置在 37 摄氏度的摇动平台上 12 到 16 小时。第二天早上，用抗生素介质将500微升活性细菌转化为50毫升LB，并在一夜之间将细菌送回摇动孵化器。将剩余的活性细菌储存分成500微升的点名，并将每个点名添加到500微升的40%甘油中，储存温度为零下80摄氏度。

为了产生大量的重组蛋白，第二天早上将细菌悬浮物以1比100的比例转化为两升LB，并将培养物返回到摇动孵化器，直到达到600纳米时0.6的吸收。然后，在培养中加入一毫摩尔IPTG，以诱导跨基因的表达。经过四到六个小时的诱导，将细菌培养转移到瓶子中进行离心，并将细菌细胞颗粒重新悬浮在每瓶60毫升PBS中。

然后通过超声波细胞干扰器释放表达重组蛋白99次，每次声波6秒，间隔12秒，每次300瓦。为了内含体净化，通过离心收集声波细菌，并将颗粒重新悬浮在适当数量的洗涤缓冲液中，以便再进行两次离心。第二次清洗后，重新悬挂内含物并重新悬浮缓冲，并留出 20 微升的样本名言用于 SDS 页面，以测试内含物的纯度。

将剩余的样品离心，并称重含有颗粒的内含物。将溶解缓冲器添加到颗粒中，最终浓度为每毫升缓冲液 30 毫克的内含体。使用磁性搅拌器在摄氏四度处缓慢搅拌溶液，直到内含物溶解在溶解缓冲区。

丢弃沉淀物后，将内含物存放在零下20或零下80摄氏度。对于 MHC 复合重新折叠，在 250 到 300 毫升时添加 5 毫摩尔减少谷胱甘肽和 0.5 毫摩尔氧化谷胱甘肽，4 摄氏度重新折叠缓冲。在4摄氏度的磁搅拌器上慢慢搅拌溶液10至20分钟。

对于 MHC 氢链和 β 两个微球蛋白稀释，将内含体装入一毫升注射器中，并将整个一毫升体积的内含体溶液注入搅拌棒附近的一升重新折叠缓冲器中，以获得快速高效的稀释。接下来，将每毫升5毫克肽溶解在二甲基硫化物中，并迅速将200微升肽注入刚刚证明的重新折叠溶液中。经过10至20分钟的缓慢搅拌后，将3毫升H链内含体注入新的一升重折叠缓冲区，让重新折叠在4摄氏度下进行8至10小时。

要确定重新折叠的蛋白质浓度，在加压室中加入10千达顿多铜氧化酶膜的交换缓冲，并将缓冲区浓缩到30至50毫升体积。将重新折叠溶液转移到离心管中，并通过离心去除沉淀物。小心地将超生体转移到腔室中，并进一步将缓冲器浓缩到大约一毫升的最终体积。

通过离心去除任何最终污染物，并将超生物转移到无菌管中。使用一个一千三百GL大小的排除列来净化蛋白质，在高峰期收集样本，并使用SDS页面分析它们。收集 MHC 复合峰值，将蛋白质浓缩到每毫升 15 毫克的最终浓度。

然后稀释复合物至每毫升浓度7.5毫克。要使用坐滴蒸汽扩散技术对复杂的 MHC 和肽进行结晶，请将样品的 0.8 微升添加到商用晶体板中并密封板。将样品溶液与 100 微升的储层溶液相平衡，温度为 4 或 18 摄氏度，并使用显微镜在未来六个月内定期观察晶体生长情况。

为了保护低温，在实验结束时，将晶体转移到含有20%甘油的储存溶液中，然后在100度开尔文气态氮气流中快速冷却样品。然后根据标准协议收集 X 射线衍射数据。要确定晶体复合物的结构，请打开香港 L 2000 软件包内 Denzo 程序中的高分辨率结构 X 射线衍射数据，并在蛋白质数据库中选择初始模型。

要确定蛋白质的结构，请打开 CCP4 中相控器 MR 计划中的数据，并使用精制 X 射线模型进行初始联合细化。然后单独使用凤凰精炼和关节模式进行X射线单独细化，并采用联合中子进行X射线精炼。每轮改进后，手动检查模型对 Fo-Fc 和 2Fo-Fc 正核密度图在库特。

在这些具有代表性的实验中，评估了亨德拉病毒衍生出亨德拉病毒一号肽的结合能力，即用同源蝙蝠β两种微球蛋白和异种人类β两种微球蛋白击打MHC I类氢链。在这两种分析中，高分辨率晶体都是通过测试版两个微球蛋白光链的重新自然形成的。在没有β两个微球蛋白的情况下，这些复合物不会形成。

在MHCI类氢链亨德拉病毒一、人类β二类微球蛋白结构中， 人类β两种微球蛋白的保存残留物H31、D53、W60和Y63，对应于蝙蝠β两种微球蛋白，与肽结合槽底部接触，保存Q8、Y10、R12和24残留物，对应于与α三域结合的β两个微球蛋白。在整体蝙蝠和人类结构中，氢链中1至184个残留物的平均根系均为0.248，表明这两个复合物之间没有区别。肽对齐的结构表明，亨德拉病毒在这两个复合物中的一个肽的确认是相当相似的。

序列对齐还表明，来自不同物种的β两种微球蛋白的氨基酸受到高度保护。重要的是要以高报告效率为对手提供综合体。因此，选择合适的β两个微球蛋白和使用高度纯化的包容体至关重要。

该协议可用于通过其他物种中潜在的β两种微球蛋白替代获得稳定的MTC I复合物，并存在它们是MTC I的结构和功能。从这些研究中获得的数据可用于评估传染病和肿瘤免疫治疗期间的T细胞反应。