In questo studio, abbiamo utilizzato Bat MHC Classe I come modello per riassumere la metodologia e valutare la fattibilità di una classe MHC ibrida I complessa con microglobulina beta-2 eterologo. Studi precedenti hanno dimostrato che la sostituzione del B2M dei mammiferi non influisce in modo significativo sulla presentazione peptidica. Infatti, l'ibrido MHC Classe I può attivare una struttura e una funzione simili alla molecola originale.
Queste tecniche possono essere utilizzate per facilitare lo studio funzionale e strutturato dell'MHC I per la valutazione della risposta tissutale durante le malattie infettive e l'immunoterapia tumorale. Per la trasformazione della coltura di E.coli aggiungere 10 nanogrammi di plasmide contenente pipistrello o MHC classe I umana beta due catena di idrogeno microglobulina a 100 microlitri di sospensione equalizzata e bagnare la sospensione nel ghiaccio per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, il calore ha scioccato i batteri per 90 secondi a 42 gradi Celsius e ha restituito la coltura al bagno di ghiaccio per due minuti.
Quindi aggiungi 800 microlitri di brodo di licogenia alla coltura e scuoti la sospensione su una piattaforma a dondolo per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto. Alla fine dell'incubazione, stendere 100 microlitri dei batteri su un'appropriata lama di coltura resistente agli antibiotici. La mattina dopo, scegli un singolo clone batterico recentemente trasformato e inocula il clone con tre millilitri di LB con mezzo antibiotico.
Posiziona la cultura sulla piattaforma a dondolo a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. La mattina seguente, trasferire 500 microlitri dello stock batterico attivato in 50 millilitri di LB con mezzo antibiotico e riportare i batteri nell'incubatrice di dondolo durante la notte. Dividere il materiale batterico attivo rimanente in 500 aliquote microliter e aggiungere ogni aliquota a 500 volumi di microliteri del 40% di glicerolo, per meno 80 gradi Celsius di stoccaggio.
Per generare grandi quantità di proteine ricombinanti, la mattina successiva trasferire la sospensione batterica in due litri di LB con mezzo antibiotico a un rapporto uno a 100 e riportare la coltura all'incubatore di dondolo fino a raggiungere un'assorbanza di 0,6 a 600 nanometri. Quindi, aggiungere un IPTG millimolare alla coltura per indurre l'espressione del gene trans. Dopo quattro o sei ore di induzione, trasferire la coltura batterica in bottiglie per la centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet di cellule batteriche in 60 millilitri di PBS per bottiglia.
Quindi liberare la proteina ricombinante espressa dal disgregatore cellulare ad ultrasuoni 99 volte, per sei secondi e un intervallo di 12 secondi a 300 Watt per sonicazione. Per l'inclusione la purificazione del corpo raccoglie i batteri sonicati mediante centrifugazione e sospende i pellet in un volume appropriato di tampone di lavaggio per due centrifugazioni aggiuntive. Dopo il secondo lavaggio, sospendere di nuovo i corpi di inclusione e il tampone di nuova sospensione e mettere da parte un'aliquota di 20 microliter del campione per la pagina SDS per testare la purezza del corpo di inclusione.
Centrifugare il campione rimanente e pesare il corpo di inclusione contenente pellet. Aggiungere il tampone di dissoluzione al pellet a una concentrazione finale di 30 milligrammi di corpo di inclusione per millilitro di tampone. E utilizzare un agitatore magnetico per mescolare lentamente la soluzione a quattro gradi Celsius, fino a quando i corpi di inclusione non vengono sciolti nel tampone di dissoluzione.
Dopo aver scartato i precipitati, conservare i corpi di inclusione a meno 20 o meno 80 gradi Celsius. Per il ripiessiamento complesso MHC, aggiungere un glutatione ridotto di cinque millimolari e un glutatione ossidato millimolare da 0,5 millimolare a 250-300 millilitri, un tampone di ripiezione di quattro gradi Celsius. E mescolare lentamente la soluzione su un agitatore magnetico a quattro gradi Celsius per 10-20 minuti.
Per la catena di idrogeno MHC e la diluizione beta di due microglobuline, caricare il corpo di inclusione in una siringa da un millilitro e iniettare l'intero volume di un millilitro di soluzione del corpo di inclusione in un litro di tampone di ripiezione vicino alla barra di agitazione, per ottenere una diluizione rapida ed efficiente. Successivamente, sciogliere cinque milligrammi per millilitro di peptide nel dimetil solfossido e iniettare rapidamente 200 microlitri di peptide nella soluzione di ripiezione come appena dimostrato. Dopo 10-20 minuti di agitazione lenta, iniettare tre millilitri di corpi di inclusione della catena H in un nuovo volume di un litro di tampone di ripiezione e consentire al ripieleggio di procedere a quattro gradi Celsius per otto-10 ore.
Per determinare la concentrazione di proteine ripiedata aggiungere tampone di scambio a una camera pressurizzata con una membrana di ossidasi multi-rame da 10 kilodalton e concentrare il buffer a un volume da 30 a 50 millilitri. Trasferire la soluzione di ripiegatura in un tubo di centrifuga e rimuovere i precipitati mediante centrifugazione. Trasferire con cura il supernate nella camera e concentrare ulteriormente il buffer su un volume finale di circa un millilitro.
Rimuovere eventuali contaminanti finali mediante centrifugazione e trasferire il supernato in un tubo sterile. Utilizzare una colonna di esclusione di diecitrecento GL per purificare le proteine, raccogliendo i campioni al picco e analizzandoli utilizzando la pagina SDS. Raccogliere il picco complesso MHC e concentrare la proteina ad una concentrazione finale di 15 milligrammi per millilitro.
Quindi diluire il complesso a 7,5 milligrammi per concentrazione di millilitro. Per eseguire la cristallizzazione del complesso MHC e peptide utilizzando la tecnica di diffusione del vapore a goccia seduta, aggiungere 0,8 microlitri del campione a una tavola di cristallo commerciale e sigillare la scheda. Equilibrare la soluzione del campione rispetto a 100 microlitri di soluzione di serbatoio a quattro o 18 gradi Celsius e utilizzare un microscopio per osservare regolarmente la crescita del cristallo nei prossimi sei mesi.
Per la protezione criogenica, al termine dell'esperimento, trasferire i cristalli in una soluzione di stoccaggio contenente il 20% di glicerolo prima di raffreddare rapidamente i campioni in un flusso di azoto gassoso Kelvin di 100 gradi. Quindi raccogliere i dati di diffrazione dei raggi X secondo i protocolli standard. Per determinare la struttura dei complessi cristallini, aprire i dati di diffrazione strutturale a raggi X ad alta risoluzione nel programma Denzo all'interno del pacchetto software HK L 2000, e selezionare un modello iniziale nella banca dati delle proteine.
Per determinare la struttura della proteina, aprire i dati nel phaser MR Program in CCP4 e utilizzare il raffinato modello a raggi-X per il perfezionamento iniziale del giunto. Quindi utilizzare la fenice affinare da sola e le modalità di giunto per la sola raffinazione a raggi X, e il neutrone articolare per la raffinatezza a raggi X. Dopo ogni ciclo di perfezionamento, controllare manualmente il modello rispetto al Fo-Fc e le mappe di densità nucleare positiva 2Fo-Fc in Coot.
In questi esperimenti rappresentativi, sono state valutate le capacità di legame del peptide Hendra Virus One derivato da Hendra Virus One per battere le catene di idrogeno MHC classe I con pipistrello beta omologo due microglobulina ed eterologo umano beta due microglobuline. In entrambe le analisi, cristalli ad alta risoluzione si sono formati attraverso la rinaturazione con la catena luminosa beta a due microglobuline. In assenza di beta due microglobuline, questi complessi non si formano.
Nella catena di idrogeno MHC classe I Hendra Virus uno, la struttura umana beta due microglobuline, residui conservati H31, D53, W60 e Y63 della microglobulina beta umana, che corrispondono alla bat beta due microglobuline, vengono a contatto con il fondo della scanalatura di legame peptidico e conservano residui Q8, Y10, R12 e 24, che corrispondono alle beta due microglobuline legate ai tre domini alfa. Nelle strutture complessive dei pipistrelli e dell'uomo, la derivazione media quadratica della radice dei residui da uno a 184 delle catene di idrogeno è 0,248 sotto tutte le sovrapposizioni dell'atomo alfa di carbonio, indicando che non ci sono differenze tra questi due complessi. La struttura dell'allineamento peptidico mostra che le conferme di Hendra Virus un peptidi in questi due complessi sono abbastanza simili.
L'allineamento delle sequenze mostra anche che gli amminoacidi di beta due microglobuline di diverse specie sono altamente conservati. È importante offrire ai complessi avversari un'elevata efficienza di reporting. Pertanto, è fondamentale selezionare beta due micro globulina adatti e utilizzare corpi di inclusione altamente purificati.
Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un complesso MTC I stabile attraverso potenziali sostituzioni beta due microglobuline in altre specie, e per esistere sono struttura e funzione MTC I. I dati ottenuti da questi studi possono essere utilizzati per valutare le risposte delle cellule T durante le malattie infettive e le immunoterapie tumorali.
