В этом исследовании мы использовали Bat MHC класса I в качестве модели для обобщения методологии, а также для оценки осуществимости гибридного класса MHC I, сложного с гетерологическим бета-2 микроглобулином. Предыдущие исследования показали, что замена млекопитающего B2M не влияет на представление пептида. В самом деле, гибридный MHC класса Я могу активировать аналогичную структуру и функции оригинальной молекулы.
Эти методы могут быть использованы для облегчения функционального и структурированного исследования MHC I для оценки реакции тканей во время инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухоли. Для преобразования культуры E.coli добавьте 10 нанограммов плазмиды, содержащей летучую мышь или бета-версию MHC I класса I, к 100 микролитров выровненной подвески и искупайте подвеску во льду в течение 30 минут. В конце инкубации, тепловой удар бактерий в течение 90 секунд при температуре 42 градусов по Цельсию, и вернуть культуру в ледяную ванну в течение двух минут.
Затем добавьте 800 микролитров лизогенного бульона в культуру и встряхните подвеску на платформе для качания в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 200 вращениях в минуту. В конце инкубации, распространение 100 микролитров бактерий на соответствующие устойчивые к антибиотикам культуры лезвие. На следующее утро, выбрать один недавно преобразованный бактериальный клон и привить клон с тремя миллилитров LB с антибиотиком среды.
Поместите культуру на платформу для качания при 37 градусах по Цельсию в течение 12-16 часов. На следующее утро перенесите 500 микролитров активированного бактериального запаса в 50 миллилитров LB с помощью антибиотиков и верните бактерии в инкубатор для качания на ночь. Разделите оставшийся активированный бактериальный запас на 500 микролитерных алицитов и добавьте каждую алициту к 500 объемам микролитров 40%глицерола, для хранения минус 80 градусов по Цельсию.
Для генерации большого количества рекомбинантного белка, на следующее утро передать бактериальную суспензию в два литра LB с антибиотиком среды на один к 100 отношение, и вернуть культуру в сковка инкубатор до поглощения 0,6 на 600 нанометров достигается. Затем добавьте один миллимолярный IPTG в культуру, чтобы вызвать экспрессию транс-гена. После четырех-шести часов индукции, передача бактериальной культуры в бутылки для центрифугации, и повторно приостановить бактериальных гранул клеток в 60 миллилитров PBS на бутылку.
Затем освободите выраженный рекомбинантный белок ультразвуковым разрушителем клеток 99 раз, в течение шести секунд и с интервалом 12 секунд при 300 ваттах на звуковое оконию. Для включения очистки организма собирают звуковые бактерии путем центрифугации и повторно приостанавливают гранулы в соответствующем объеме стирального буфера для двух дополнительных центрифуг. После второй стирки, повторно приостановить включение органов и повторной подвески буфера, и выделить 20 микролитер aliquot образца для страницы SDS для проверки чистоты тела включения.
Центрифуга оставшийся образец, и весят включения тела, содержащего гранулы. Добавьте буфер растворения к гранулам к окончательной концентрации 30 миллиграммов тела включения на миллилитр буфера. И используйте магнитный мешалку, чтобы медленно перемешать раствор при четырех градусах по Цельсию, пока тела включения не растворяются в буфере растворения.
После сброса осадков, хранить включения органов при минус 20 или минус 80 градусов по Цельсию. Для комплексного рефолсирования MHC добавьте пятимилимолярный глутатион и 0,5 миллимолярный окисляемый глутатион на 250-300 миллилитров, буфер повторного сплещения на четыре градуса Цельсия. И медленно перемешать раствор на магнитной мешалки при четырех градусах по Цельсию в течение 10 до 20 минут.
Для MHC водородной цепи и бета два микроглобулина разбавления, загрузить включение тела в один миллилитр шприц и ввести весь один миллилитр объем включения тела раствор в один литр сверления буфера вблизи перемешать бар, чтобы получить быстрое и эффективное разбавление. Затем растворите пять миллиграммов на миллилитр пептида в диметилсульфоксиде и быстро ввилите 200 микролитров пептида в раствор для сверяния, как это было продемонстрировано. После 10 до 20 минут медленного перемешивания, введать три миллилитров H цепи включения органов в новый один литр объема повторного буфера и позволяют повторного продолжения при четырех градусах по Цельсию в течение восьми до 10 часов.
Для определения сжатой концентрации белка добавьте буфер обмена в герметичную камеру с мембраной оксидазы 10 килодальтонов с много медью и сконцентрируйте буфер до 30-50 миллилитров объема. Перенесите раствор рефолсирования в центрифугу и удалите осадки центрифугой. Аккуратно перенесите супернат в камеру и далее сконцентрируйте буфер на конечный объем примерно в миллилитр.
Удалите любые окончательные загрязняющие вещества путем центрифугации и перенесите супернят в стерильную трубку. Используйте десять трехсот столбец исключения размера GL для очистки белков, сбора образцов на пике и анализа их с помощью страницы SDS. Соберите пик комплекса MHC и сконцентрировать белок до конечной концентрации 15 миллиграммов на миллилитр.
Затем разбавить комплекс до 7,5 миллиграммов на миллилитр концентрации. Для выполнения кристаллизации комплекса MHC и пептида с использованием метода диффузии паров сидя капли, добавьте 0,8 микролитров образца в коммерческую кристаллическую доску и запечатайте доску. Равноденствие образцового раствора против 100 микролитров раствора резервуара при 4 или 18 градусах цельсия, и используйте микроскоп, чтобы регулярно наблюдать рост кристалла в течение следующих шести месяцев.
Для криогенной защиты, в конце эксперимента, перенесите кристаллы в раствор для хранения, содержащий 20%глицерол, прежде чем быстро охлаждать образцы в 100-градусном газозвуковой поток азота Кельвина. Затем соберите данные рентгеновской дифракции в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы определить структуру кристаллических комплексов, откройте структурные данные о дифракции высокого разрешения в программе Denzo в рамках пакета программного обеспечения HK L 2000 и выберите начальную модель в банке данных о белках.
Чтобы определить структуру белка, откройте данные в Phaser MR Program в CCP4 и используйте усовершенствованную рентгеновую модель для первоначального уточнения суставов. Затем используйте Феникс уточнить в одиночку и совместных режимов для рентгеновского самостоятельно уточнения, и совместный нейтрон для рентгеновского уточнения. После каждого раунда уточнения, вручную проверить модель против Fo-Fc, и 2Fo-Fc положительной ядерной плотности карты в Кут.
В этих репрезентативных экспериментах были оценены связывающие способности вируса Хендра, полученные пептидом Hendra Virus One для водородной цепи типа MHC с гомологичной бета-версией летучих мышей двух микроглобулиных и гетерологических бета-версий человека двумя микроглобулинами. В обоих анализах кристаллы с высоким разрешением образовались в результате ренатурации с помощью бета-двух микроглобулиных световых цепочек. При отсутствии бета-двух микроглобулинов эти комплексы не образуются.
В водородной цепи MHC класса I Hendra Virus one, человеческая бета-структура двух микроглобулинов, сохраненные остатки H31, D53, W60 и Y63 бета-версии человека два микроглобулина, которые соответствуют бета летучей мыши два микроглобулина, ввести контакт с нижней части пептида связывания паз и сохраняется No 8, Y10, R12, и 24 остатков, которые соответствуют бета-двух микроглобулинов связаны с альфа-три домена. В общей структуре летучих мышей и человека средний уровень происхождения остатков от 1 до 184 водородных цепей составляет 0,248 при всех суперпозициях атома альфа-углерода, что указывает на отсутствие различий между этими двумя комплексами. Структура выравнивания пептида показывает, что подтверждения вируса Хендра один пептиды в этих двух комплексах очень похожи.
Выравнивание последовательности также показывает, что аминокислоты бета-двух микроглобулинов разных видов очень консервативны. Важно предлагать комплексы противника с высокой эффективностью отчетности. Поэтому крайне важно выбрать подходящую бета-версию двух микроглобулина и использовать высокоочищенные органы включения.
Этот протокол может быть использован для получения стабильного комплекса MTC I через потенциальную бета-версию двух микроглобулиных замен у других видов, и для существования они являются структурой и функцией MTC I. Данные, полученные в ходе этих исследований, могут быть использованы для оценки реакции Т-клеток при инфекционных заболеваниях и иммунотерапии опухолей.
