Neste estudo, utilizamos o Bat MHC Classe I como modelo para resumir a metodologia e avaliar a viabilidade de uma classe I de MHC híbrida complexada com microglobulina beta-2 heterologous. Estudos anteriores mostraram que a substituição de mamíferos B2M não afeta significativamente a apresentação do peptídeo. Na verdade, o híbrido MHC Classe I pode ativar uma estrutura e função semelhantes à molécula original.
Essas técnicas podem ser utilizadas para facilitar o estudo funcional e estruturado do MHC I para avaliação de resposta tecidual durante doenças infecciosas e imunoterapia tumoral. Para a transformação da cultura E.coli adicione 10 nanogramas de plasmídeo contendo morcego ou mhc humano classe I beta duas cadeias de hidrogênio microglobulina a 100 microliters de suspensão igualada e banhar a suspensão no gelo por 30 minutos. No final da incubação, o calor choca as bactérias por 90 segundos a 42 graus Celsius, e devolve a cultura ao banho de gelo por dois minutos.
Em seguida, adicione 800 microliters de caldo de lysogeny à cultura, e agite a suspensão em uma plataforma de balanço por 20 minutos a 37 graus Celsius, e 200 rotações por minuto. No final da incubação, espalhe 100 microlitadores da bactéria em uma lâmina de cultura resistente a antibióticos apropriada. Na manhã seguinte, escolha um único clone bacteriano recentemente transformado e inocula o clone com três mililitros de LB com meio antibiótico.
Coloque a cultura na plataforma de balanço a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Na manhã seguinte, transfira 500 microliters do estoque bacteriano ativado para 50 mililitros de LB com meio antibiótico, e devolva as bactérias para a incubadora de rochas durante a noite. Divida o estoque bacteriano ativado restante em 500 alíquotas de microliter e adicione cada alíquota a 500 volumes de microliter de 40% glicerol, para armazenamento de menos 80 graus Celsius.
Para gerar grandes quantidades de proteína recombinante, na manhã seguinte transfira a suspensão bacteriana em dois litros de LB com meio antibiótico em uma proporção de um a 100, e devolva a cultura à incubadora de balanço até que uma absorção de 0,6 a 600 nanômetros seja alcançada. Em seguida, adicione um IPTG milimolar à cultura para induzir a expressão do gene trans. Após quatro a seis horas de indução, transfira a cultura bacteriana para garrafas para centrifugação, e suspenda as pelotas de células bacterianas em 60 mililitros de PBS por garrafa.
Em seguida, libira a proteína recombinante expressa por disruptor de células ultrassônicas 99 vezes, por seis segundos e um intervalo de 12 segundos a 300 Watts por sônicação. Para inclusão, a purificação corporal recolhe as bactérias sonicadas por centrifugação e suspende as pelotas em um volume apropriado de tampão de lavagem para duas centrífugas adicionais. Após a segunda lavagem, suspenda os corpos de inclusão e o tampão de suspensão, e reserve uma alíquota de 20 microliteres da amostra para a página SDS para testar a pureza corporal de inclusão.
Centrifugar a amostra restante e pesar o corpo de inclusão contendo pelotas. Adicione o tampão de dissolução às pelotas a uma concentração final de 30 miligramas de corpo de inclusão por mililitro de tampão. E use um agitador magnético para agitar lentamente a solução a quatro graus Celsius, até que os corpos de inclusão sejam dissolvidos no tampão de dissolução.
Depois de descartar os precipitados, armazene os corpos de inclusão a menos 20 ou menos 80 graus Celsius. Para repatos complexos MHC, adicione uma glutationa reduzida de cinco milimoslar e glutationa oxidada de 0,5 milimolar a 250 a 300 mililitros, um tampão de ressarcimento de quatro graus Celsius. E mexa lentamente a solução em um agitador magnético a quatro graus Celsius por 10 a 20 minutos.
Para a cadeia de hidrogênio MHC e beta duas diluições de microglobulina, carregue o corpo de inclusão em uma seringa de um mililitro e injete todo o volume de um mililitro da solução corporal de inclusão em um litro de tampão de recarregamento perto da barra de rebulação, para obter uma diluição rápida e eficiente. Em seguida, dissolver cinco miligramas por mililitro de peptídeo em sulfoxida de dimetila, e injetar rapidamente 200 microliters de peptídeo na solução de repato, como apenas demonstrado. Após 10 a 20 minutos de agitação lenta, injete três mililitros de corpos de inclusão da cadeia H em um novo volume de um litro de tampão de re dobra e permita que o redobramento prossiga em quatro graus Celsius por oito a 10 horas.
Para determinar a concentração de proteína redobrada adicione o tampão de troca a uma câmara pressurizada com uma membrana oxidase multi cobre de 10 kilodalton, e concentre o buffer em volume de 30 a 50 mililitros. Transfira a solução de reabascamento para um tubo de centrífuga e remova os precipitados por centrifugação. Transfira cuidadosamente o supernato para a câmara e concentre ainda mais o buffer para um volume final de aproximadamente um mililitro.
Remova os contaminantes finais por centrifugação e transfira o supernato para um tubo estéril. Use uma coluna de exclusão de tamanho de 10 300 GL para purificar as proteínas, coletando as amostras no pico e analisando-as usando a página SDS. Colete o pico complexo de MHC e concentre a proteína em uma concentração final de 15 miligramas por mililitro.
Em seguida, diluir o complexo para 7,5 miligramas por concentração mililitro. Para realizar a cristalização do complexo MHC e peptídeo utilizando a técnica de difusão de vapor de gota sentada, adicione 0,8 microliters da amostra a uma placa de cristal comercial e selado a placa. Equilibre a solução amostral contra 100 microlitros de solução de reservatório a quatro ou 18 graus Celsius, e use um microscópio para observar regularmente o crescimento do cristal nos próximos seis meses.
Para proteção criogênica, no final do experimento, transfira os cristais para uma solução de armazenamento contendo 20% de glicerol antes de esfriar rapidamente as amostras em um fluxo de nitrogênio gasoso Kelvin de 100 graus. Em seguida, colete dados de difração de raios-X de acordo com os protocolos padrão. Para determinar a estrutura dos complexos de cristal, abra os dados estruturais de difração de raios-X de alta resolução no programa Denzo dentro do pacote de software HK L 2000 e selecione um modelo inicial no banco de dados de proteínas.
Para determinar a estrutura da proteína, abra os dados no Programa Phaser MR em CCP4 e utilize o modelo de raio-x refinado para o refinamento inicial da articulação. Em seguida, use o refino phoenix sozinho e modos articulares para o refinamento de raio-x sozinho, e o nêutron articular para o refinamento de raios-X. Após cada rodada de refinamento, verifique manualmente o modelo contra os mapas de densidade nuclear positivos do Fo-Fc e 2Fo-Fc em Coot.
Nestes experimentos representativos, foram avaliadas as capacidades de ligação do vírus Hendra, o vírus Hendra One, para rebater as cadeias de hidrogênio CLASSE I do MHC com morcego homólogo beta dois microglobulina e beta humano heterologous duas microglobulina. Em ambas as análises, cristais com alta resolução foram formados através da renaturação com a cadeia de luz beta duas microglobulina. Na ausência de beta duas microglobulinas, esses complexos não se formam.
Na cadeia de hidrogênio CLASSE I DO MHC Hendra Virus um, beta humano duas microglobulinas, resíduos conservados H31, D53, W60, e Y63 de beta humano duas microglobulina, que correspondem ao morcego beta duas microglobulina, fazem contato com a parte inferior do sulco de ligação de peptídeos e conservaram Q8, Y10, R12 e 24 resíduos, que correspondem aos dois microglobulinas beta ligados ao domínio alfa três. No morcego geral e nas estruturas humanas, a média de derivação quadrada média de resíduos de uma a 184 cadeias de hidrogênio é de 0,248 sob todas as superposições do átomo alfa de carbono, indicando que não há diferenças entre esses dois complexos. A estrutura do alinhamento do peptídeo mostra que as confirmações do Vírus Hendra um peptídeos nesses dois complexos são bastante semelhantes.
O alinhamento da sequência também mostra que os aminoácidos de beta duas microglobulinas de diferentes espécies são altamente conservados. É importante oferecer aos complexos adversários uma alta eficiência de relatórios. Portanto, é crucial selecionar beta dois micro globulina adequados e usar corpos de inclusão altamente purificados.
Este protocolo pode ser usado para obter complexo estável de MTC I através de potenciais substituições beta duas microglobulinas em outras espécies, e para existir são estrutura e função MTC I. Os dados obtidos a partir desses estudos podem ser usados para avaliar as respostas das células T durante doenças infecciosas e imunoterapias tumorais.
