במחקר זה השתמשנו בבת MHC Class I כמודל לסיכום המתודולוגיה, ולהעריך את ההיתכנות של כיתת MHC היברידית שהרכבתי עם מיקרוגלובולין בטא-2 הטרולוגי. מחקרים קודמים הראו כי החלפת B2M יונק אינו משפיע באופן משמעותי על מצגת פפטיד. למעשה, MHC היברידית Class אני יכול להפעיל מבנה דומה פונקציה למולקולה המקורית.
טכניקות אלה יכולות לשמש כדי להקל על המחקר הפונקציונלי והמבנה של MHC I להערכת תגובת רקמות במהלך מחלות זיהומיות ואימונותרפיה הגידול. עבור שינוי תרבות E.coli להוסיף 10 ננוגרם של פלסמיד המכיל עטלף או אדם MHC Class I בטא שני שרשרת מימן microglobulin ל 100 microliters של השעיה שווה לרחוץ את ההשעיה בקרח במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, חום הלם החיידקים במשך 90 שניות ב 42 מעלות צלזיוס, ולהחזיר את התרבות לאמבטיית הקרח במשך שתי דקות.
לאחר מכן להוסיף 800 microliters של מרק lysogeny לתרבות, ולנער את ההשעיה על פלטפורמת נדנדה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 200 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, להפיץ 100 microliters של החיידקים על להב תרבות עמיד לאנטיביוטיקה המתאים. למחרת בבוקר, לבחור שיבוט חיידקי אחד שהפך לאחרונה לחסן את השיבוט עם שלושה מיליליטר של LB עם מדיום אנטיביוטי.
מניחים את התרבות על פלטפורמת הנדנדה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 עד 16 שעות. למחרת בבוקר, להעביר 500 microliters של מלאי חיידקים מופעל לתוך 50 מיליליטר של LB עם מדיום אנטיביוטי, ולהחזיר את החיידקים לחממת נדנדה לילה. לפצל את מלאי חיידקים מופעל הנותרים לתוך 500 aliquots microliter ולהוסיף כל aliquot ל 500 נפחי microliter של 40% גליצרול, עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.
כדי ליצור כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי, למחרת בבוקר להעביר את ההשעיה החיידקית לתוך שני ליטרים של LB עם מדיום אנטיביוטי ביחס של 1 עד 100, ולהחזיר את התרבות לאינקובטור נדנדה עד ספיגה של 0.6 ב 600 ננומטר מושגת. לאחר מכן, להוסיף IPTG מילימולארי אחד לתרבות כדי לגרום לביטוי של הגן טרנס. לאחר ארבע עד שש שעות של אינדוקציה, להעביר את תרבות החיידקים לבקבוקים עבור צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את כדורי תא חיידקי ב 60 מיליליטר של PBS לכל בקבוק.
ואז לשחרר את החלבון רקומביננטי לידי ביטוי על ידי משבש תא קולי 99 פעמים, במשך שש שניות מרווח של 12 שניות ב 300 וואט לכל sonication. לטיהור הגוף הכללה לאסוף את החיידקים sonicated על ידי צנטריפוגה להשעות מחדש את כדורי בנפח המתאים של חיץ כביסה עבור שני צנטריפוגות נוספות. לאחר הכביסה השנייה, להשעות מחדש את גופי ההכללה ואת מאגר ההשעיה מחדש, ולהניח בצד aliquot 20 microliter של המדגם עבור דף SDS כדי לבדוק את טוהר הגוף הכללה.
צנטריפוגה המדגם הנותר, ולשקול את הגוף הכללה המכיל גלולה. הוסף מאגר פירוק כדורי לריכוז הסופי של 30 מיליגרם של גוף הכללה לכל מיליליטר של חיץ. ולהשתמש stirrer מגנטי כדי לבחוש לאט את הפתרון בארבע מעלות צלזיוס, עד גופי הכללה מומסים חיץ פירוק.
לאחר השלכת המשקעים, יש לאחסן את גופי ההכללה במינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור refolding מורכב MHC, להוסיף גלוטתיון מופחת חמישה מילימולאר ו 0.5 גלוטתיון מחומצן מילימולאר ב 250 עד 300 מיליליטר, מאגר ארבע מעלות צלזיוס refolding. ולאט לאט מערבבים את הפתרון על stirrer מגנטי בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 עד 20 דקות.
עבור שרשרת מימן MHC ובטא שני דילול microglobulin, לטעון את גוף ההכללה במזרק מיליליטר אחד ולהזריק את כל נפח מיליליטר אחד של פתרון גוף הכללה לתוך ליטר אחד של חיץ refolding ליד בר ערבוב, כדי לקבל דילול מהיר ויעיל. לאחר מכן, להמיס חמישה מיליגרם למיליליטר של פפטיד ב dimethyl sulphoxide, במהירות להזריק 200 microliters של פפטיד לתוך פתרון refolding כפי שהוכח רק. לאחר 10 עד 20 דקות של ערבוב איטי, להזריק שלושה מיליליטר של גופי הכללת שרשרת H לתוך נפח ליטר חדש של חיץ refolding ולאפשר refolding להמשיך בארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה עד 10 שעות.
כדי לקבוע את ריכוז החלבון refolded להוסיף חיץ חילופי לתא בלחץ עם קרום 10 קילודלטון multi נחושת אוקסידאז, ולרכז את החיץ ל 30 עד 50 נפח מיליליטר. להעביר את פתרון refolding לצינור צנטריפוגה, ולהסיר את המשקעים על ידי צנטריפוגה. בזהירות להעביר את supernate לתוך התא ולרכז עוד יותר את החיץ לנפח הסופי של כמיליליטר אחד.
הסר את כל המזהמים הסופיים על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernate לתוך צינור סטרילי. השתמש בעמודת אי-הכללה בגודל 1030 GL כדי לטהר את החלבונים, לאסוף את הדגימות בשיא, ולנתח אותן באמצעות דף SDS. לאסוף את השיא המורכב MHC ולרכז את החלבון לריכוז סופי של 15 מיליגרם למיליליטר.
ואז לדלל את המתחם ל 7.5 מיליגרם לריכוז מיליליטר. כדי לבצע התגבשות של MHC מורכב ופפטיד באמצעות טכניקת דיפוזיה אדי ישיבה, להוסיף 0.8 microliters של המדגם ללוח גביש מסחרי ולאטום את הלוח. השווה את פתרון המדגם מול 100 מיקרוליטרים של פתרון המאגר בארבע או 18 מעלות צלזיוס, והשתמש במיקרוסקופ כדי לצפות באופן קבוע בצמיחת הגבישים במהלך ששת החודשים הבאים.
להגנה קריוגנית, בסוף הניסוי, להעביר את הגבישים לתמיסת אחסון המכיל 20% גליצרול לפני קירור מהיר את הדגימות בזרם חנקן גזי קלווין 100 מעלות. לאחר מכן לאסוף נתוני עקיפת רנטגן על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לקבוע את מבנה מתחמי הגבישים, פתח את נתוני עקיפת קרני הרנטגן המבניים ברזולוציה גבוהה בתוכנית Denzo בתוך חבילת התוכנה HK L 2000 ובחר מודל ראשוני בתחום נתוני החלבון.
כדי לקבוע את מבנה החלבון, פתח את הנתונים בתוכנית MR של פייזר ב- CCP4 והשתמש במודל הרנטגן המעודן לעידון המפרקים הראשוני. לאחר מכן השתמשו בפיניקס כדי לחדד לבד ובמצבי המפרקים לעידון הרנטגן לבדו, ואת הנויטרון המשותף לעידון קרני הרנטגן. לאחר כל סבב של עידון, לבדוק באופן ידני את המודל מול Fo-Fc, ו 2Fo-Fc מפות צפיפות גרעינית חיובית Coot.
בניסויים ייצוגיים אלה, היכולות המחייבות של וירוס הנדרה נגזר וירוס הנדרה אחד פפטיד כדי לחבוט MHC Class I שרשראות מימן עם בטא עטלף הומולוגי שני microglobulin ו בטא אנושי הטרולוגי שני microglobulin הוערכו. בשני הניתוחים, גבישים ברזולוציה גבוהה נוצרו באמצעות התחדשות עם שרשרת אור בטא שתי מיקרוגלובולין. בהיעדר בטא שני מיקרוגלובולין, קומפלקסים אלה אינם נוצרים.
בשרשרת המימן MHC Class I וירוס הנדרה אחד, בטא אנושי שני מבנה microglobulin, שאריות שמורות H31, D53, W60, ו- Y63 של בטא אנושית שני microglobulin, אשר תואמים בטא עטלף שני microglobulin, ליצור קשר עם החלק התחתון של גרוב מחייב פפטיד ושמר Q8, Y10, R12, ו 24 שאריות, אשר תואמים את בטא שני microglobulins מאוגדים לאלפא שלושה תחומים. במבנים הכוללים של העטלף והאנושי, השורש הממוצע אומר נגזרת ריבועית של שאריות אחת עד 184 של שרשראות המימן הוא 0.248 תחת כל superpositions של אטום אלפא פחמן, המציין כי אין הבדלים בין שני מתחמים אלה. המבנה של יישור פפטיד מראה כי האישורים של וירוס הנדרה פפטידים אחד בשני מתחמים אלה דומים למדי.
יישור רצף גם מראה כי חומצות האמינו של בטא שני microglobulin ממינים שונים שמורים מאוד. חשוב להציע למתחמי היריב יעילות דיווח גבוהה. לכן, חיוני לבחור בטא מתאים שני גלובולין מיקרו ולהשתמש בגופי הכללה מטוהרים מאוד.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשיג MTC יציב אני מורכב באמצעות בטא פוטנציאלי שתי תחליפים microglobulin במינים אחרים, להתקיים הם MTC אני מבנה ותפקוד. הנתונים המתקבלים ממחקרים אלה יכולים לשמש להערכת תגובות תאי T במהלך מחלות זיהומיות ואימונותרפיות גידול.
