Bu çalışmada, metodolojiyi özetlemek ve heterolog beta-2 mikroglobulin ile karmaşık hale gelen hibrit bir MHC sınıfının fizibilitesini değerlendirmek için model olarak Bat MHC Class I'i kullandık. Önceki çalışmalar, memeli B2M ikamesinin peptit sunumını önemli ölçüde etkilemediğini göstermiştir. Aslında, hibrid MHC Sınıfı I, orijinal moleküle benzer bir yapıyı ve işlevi etkinleştirebilir.
Bu teknikler, bulaşıcı hastalık ve tümör immünoterapisi sırasında doku yanıtı değerlendirmesi için MHC I'in fonksiyonel ve yapılandırılmış çalışmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. E.coli kültür dönüşümü için, 100 mikrolitre eşitlenmiş süspansiyona yarasa veya insan MHC Sınıf I beta iki mikroglobulin hidrojen zinciri içeren 10 nanogram plazmid ekleyin ve süspansiyonu 30 dakika boyunca buzda yıkayın. Kuluçkanın sonunda, ısı bakterileri 42 santigrat derecede 90 saniye boyunca şok eder ve kültürü iki dakika boyunca buz banyosuna geri döndürür.
Daha sonra kültüre 800 mikrolitre lysojeny suyu ekleyin ve süspansiyonu 37 santigrat derecede 20 dakika sallanan bir platformda ve dakikada 200 dönüş sallayın. Kuluçkanın sonunda, bakterilerin 100 mikrolitresini uygun bir antibiyotiğe dirençli kültür bıçağına yayın. Ertesi sabah, yakın zamanda dönüştürülmüş tek bir bakteri klonu seçin ve klonu antibiyotik ortamı ile üç mililitre LB ile aşıla.
Kültürü 12 ila 16 saat boyunca 37 santigrat derecede sallanan platforma yerleştirin. Ertesi sabah, aktif bakteri stoğunun 500 mikrolitresini antibiyotik ortamı ile 50 mililitre LB'ye aktarın ve bakterileri bir gecede sallanan inkübatöre geri verin. Kalan aktif bakteri stoğunu 500 mikroliter aliquot'a bölün ve eksi 80 santigrat derece depolama için her bir aliquot'ı% 40 gliserrol'ün 500 mikroliter hacmine ekleyin.
Büyük miktarlarda rekombinant protein üretmek için, ertesi sabah bakteriyel süspansiyonu bir ila 100 oranında antibiyotik ortamı ile iki litre LB'ye aktarın ve 600 nanometrede 0.6 absorban elde edilene kadar kültürü sallanan inkübatöre geri verin. Daha sonra, trans genin ekspresyonunun teşviki için kültüre bir milimolar IPTG ekleyin. Dört ila altı saat indüksiyondan sonra, bakteri kültürünü santrifüjleme için şişelere aktarın ve bakteri hücresi peletlerini şişe başına 60 mililitre PBS'de yeniden askıya alın.
Daha sonra ifade edilen rekombinant proteini ultrasonik hücre bozucu tarafından 99 kez, altı saniye ve sonikasyon başına 300 Watt'ta 12 saniyelik bir aralıkla serbest. dahil vücut saflaştırma için sonicated bakterileri santrifüjleme ile toplayın ve peletleri iki ek santrifüj için uygun bir yıkama tamponu hacminde yeniden askıya alın. İkinci yıkamadan sonra, dahil etme gövdelerini ve yeniden süspansiyon tamponu yeniden askıya alın ve dahil etme gövdesi saflığını test etmek için SDS sayfası için numunenin 20 mikroliter aliquot'ını ayırın.
Kalan numuneyi santrifüj edin ve pelet içeren dahil etme gövdesini tartın. Mililitre tampon başına 30 miligramlık dahil etme gövdesinin son konsantrasyonuna peletlere çözünme tamponu ekleyin. Ve çözeltiyi dört santigrat derecede yavaşça karıştırmak için manyetik bir karıştırıcı kullanın, ta ki inklüzyon kütleleri çözünme tamponunda çözünene kadar.
Çökeltmeleri attıktan sonra, içerme gövdelerini eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. MHC karmaşık yeniden katlama için, beş milimoler azaltılmış glutatyon ve 250 ila 300 mililitrede 0,5 milimoler oksitlenmiş glutatyon ekleyin, dört santigrat derecelik bir yeniden katlama tamponu. Ve çözeltiyi 10 ila 20 dakika boyunca dört santigrat derecede manyetik bir karıştırıcıda yavaşça karıştırın.
MHC hidrojen zinciri ve beta iki mikroglobulin seyreltme için, dahil etme gövdesini bir mililitre şırıngaya yükleyin ve hızlı ve verimli bir seyreltme elde etmek için bir mililitre hacimli dahil etme gövdesi çözeltisinin tamamını karıştırma çubuğunun yakınındaki bir litre yeniden katlama tamponuna enjekte edin. Daha sonra, mililitre peptit başına beş miligramı dimetil sülfooksit içinde çözün ve az önce gösterildiği gibi yeniden katlama çözeltisine hızlı bir şekilde 200 mikrolitre peptit enjekte edin. 10 ila 20 dakika yavaş karıştırdıktan sonra, üç mililitre H zincirli inklüzyon gövdesini yeni bir litre hacimli yeniden katlama tamponuna enjekte edin ve yeniden işlemenin sekiz ila 10 saat boyunca dört santigrat derecede devam etmesine izin verin.
Yeniden katlanmış protein konsantrasyonunu belirlemek için, 10 kilodalton çoklu bakır oksidaz zarı olan basınçlı bir odaya değişim tamponu ekleyin ve tamponu 30 ila 50 mililitre hacme konsantre edin. Yeniden katlama çözeltisini bir santrifüj tüpüne aktarın ve çökeltmeleri santrifüjleme ile çıkarın. Süpernatı dikkatlice odaya aktarın ve tamponu yaklaşık bir mililitrelik son hacme daha fazla konsantre edin.
Santrifüjleme ile son kirleticileri çıkarın ve süpernatı steril bir tüpe aktarın. Proteinleri arındırmak, örnekleri zirvede toplamak ve SDS sayfasını kullanarak analiz etmek için on üç yüz GL boyutu dışlama sütunu kullanın. MHC karmaşık tepe noktasını toplayın ve proteini mililitre başına 15 miligramlık son konsantrasyona konsantre edin.
Daha sonra kompleksi mililitre konsantrasyonu başına 7,5 miligrama seyreltin. Oturma damlası buharı difüzyon tekniğini kullanarak karmaşık MHC ve peptidin kristalizasyonunu gerçekleştirmek için, numunenin 0,8 mikrolitresini ticari bir kristal tahtaya ekleyin ve kartı kapatın. Numune çözeltisini dört veya 18 santigrat derecede 100 mikrolitre rezervuar çözeltisine karşı dengeleyin ve önümüzdeki altı ay boyunca kristal büyümesini düzenli olarak gözlemlemek için bir mikroskop kullanın.
Kriyojenik koruma için, deneyin sonunda, numuneleri 100 derece Kelvin gazlı azot akışında hızla soğutmadan önce kristalleri% 20 gliserol içeren bir depolama çözeltisine aktarın. Ardından standart protokollere göre x-ray kırınım verilerini toplayın. Kristal komplekslerinin yapısını belirlemek için, HK L 2000 yazılım paketindeki Denzo programındaki yüksek çözünürlüklü yapısal x-ışını kırınım verilerini açın ve protein veri bankasında bir başlangıç modeli seçin.
Proteinin yapısını belirlemek için CCP4'teki Phaser MR Programı'ndaki verileri açın ve ilk eklem iyileştirmesi için rafine x-ray modelini kullanın. Daha sonra phoenix rafine tek başına ve ortak modları x-ray tek başına arıtma için kullanın, ve x-ışını arıtma için ortak nötron. Her arıtma turundan sonra, modeli Fo-Fc ve Coot'taki 2Fo-Fc pozitif nükleer yoğunluk haritaları ile manuel olarak kontrol edin.
Bu temsili deneylerde, Hendra Virüsü türetilmiş Hendra Virüsü Bir peptidin homolog yarasa beta iki mikroglobulin ve heterolog insan beta iki mikroglobulin ile MHC Sınıf I hidrojen zincirlerine bağlanma kapasiteleri değerlendirildi. Her iki analizde de beta iki mikroglobulin ışık zinciri ile yeniden doyma yoluyla yüksek çözünürlüğe sahip kristaller oluşmuştur. Beta iki mikroglobulin yokluğunda, bu kompleksler oluşmaz.
MHC Sınıf I hidrojen zinciri Hendra Virüs bir, insan beta iki mikroglobulin yapısı, insan beta iki mikroglobulin korunmuş kalıntılar H31, D53, W60, ve Y63 insan beta iki mikroglobulin, peptit bağlayıcı oluk alt ile temas yapmak ve Q8, Y10, R12, ve 24 kalıntılar, alfa üç etki alanına bağlı beta iki mikroglobulins karşılık gelir. Genel yarasa ve insan yapılarında, hidrojen zincirlerinin bir ila 184'lü kalıntılarının ortalama kök ortalama kare derivasyonu, karbon alfa atomunun tüm süperpozisyonlarının altında 0,248'dir ve bu iki kompleks arasında hiçbir fark olmadığını gösterir. Peptit hizalamasının yapısı, hendra virüsünün bu iki kompleksteki bir peptit onaylarının oldukça benzer olduğunu göstermektedir.
Dizi hizalaması ayrıca beta iki mikroglobulinin farklı türlerden amino asitlerinin yüksek oranda korunmuş olduğunu göstermektedir. Rakip kompleksleri yüksek raporlama verimliliği ile sunmak önemlidir. Bu nedenle, uygun beta iki mikro globulin seçmek ve son derece saflaştırılmış inklüzyon cisimleri kullanmak çok önemlidir.
Bu protokol, diğer türlerde potansiyel beta iki mikroglobulin ikameleri yoluyla kararlı MTC I kompleksi elde etmek için kullanılabilir ve var olmak için MTC I yapısı ve işlevidir. Bu çalışmalardan elde edilen veriler, enfeksiyöz hastalık ve tümör immünoterapileri sırasında T hücre yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir.
