本视频中演示的协议使我们能够了解肠道代谢物在真菌催眠形态生成中的作用。这种外体技术或多或少是肠道研究真菌催眠形态的最接近近似值，无法进行体外研究。该方法可用于研究肠道代谢物在其他肠道病原体中的作用。
使用解洗消毒的尖端剪刀和钳子解剖小鼠。安乐死后，通过固定所有四肢露出腹部，将动物固定在解剖表面。用70%乙醇喷洒腹部区域，防止毛皮粘在钳子、剪刀或肠道部分。
使用钳子捏合和抬起腹部底部的一段皮肤，并通过皮肤和基础筋膜创建一个小切口，注意避免刺穿 cecum 或肠壁。将此切口扩展到肋骨部分露出腹腔，然后从两侧初始切口点开始切割，向上和横向延伸。横向拉动这些活门，将其固定在解剖表面，以完全暴露腹腔。
用钳子提取胃肠道，同时用剪刀使切口优于胃和大肠的腹外区域，以确保收集最大的肠道含量。取出胃肠道时，注意避免损坏各个部件。分离胃，小肠，切库姆和大肠在他们的近端和近端。
要收集每个部分的肠道内容物，在远端进行单个切口，然后手动将肠道内容物排出 1.5 毫升微离心管中。将样品储存在零下80摄氏度，进行外体测定。将 C. albicans SC5314 的新鲜文化带到 Ypd 阿加盘上， 在 30 摄氏度下孵育过夜。
第二天，选择两到三个中等大小的个体菌落，并在一毫升PBS中重新暂停。从冰柜中取出冷冻的肠道内装物，并在25摄氏度下解冻。将大约150毫克的肠道内装物转移到新的1.5毫升管中，然后用150微升PBS重新发送。
高速旋转样品30秒，使肠道内物均匀化，并允许其在室温下坐约一分钟。将同质物在1000次G下离心3分钟，然后将上分液转移到新的1.5毫升管中，注意不转移任何碎屑。重复离心后，在上经剂中加入10微升的C.albicans inculum，混合良好，并在37摄氏度下孵育样品4至5小时。
要测试外源代谢物对C.albicans的影响，将所需的代谢物浓度添加到肠道含量和PBS混合物中，然后高速旋转样品30秒，让它在室温下坐10分钟，并如前所述进行离心和接种。将真菌细胞培养在1000倍G下离心两分钟，然后丢弃上经剂。将样品在 2%PFA 的 100 微升中固定 15 分钟，然后重复离心并丢弃上经剂。
根据手稿方向用一毫升 PBS 清洗样品两次，然后在室温下用聚克隆 C.albicans 抗体在 100 微升 PBS 中孵育样品 30 分钟。孵育后，用PBS将样品清洗三次，在昏暗的灯光下工作，避免光漂白。在黑暗的房间里，在室温下孵育样品15分钟，在含有抗兔IgG Alexa Fluor 488抗体的100微升PBS中孵育15分钟，稀释1至500。
用一毫升 PBS 洗涤样品三次后，将其重新用 100 微升 PBS 中重新暂停，并转移到 96 井板进行成像。使用荧光成像显微镜使用 20X 和 40 倍物镜以及绿色荧光蛋白过滤器对真菌细胞进行成像。当C.albicans在从胃、小肠和大肠中提取的肠道同质物中提取的外体中生长时，它通常与酵母形态形成。
然而，当从抗生素治疗的小鼠的cesal提取物中生长时，C.albicans很容易经历形态形成，导致酵母和催眠形式。这表明抗生素治疗导致细胞环境的变化，从而诱发C.Albicans的催眠形态。抗生素治疗小鼠的 cecal 均质的外源性添加葡萄糖，在体内表现出巨大的催眠发育。
这些结果表明，将肠道代谢物加入抗生素治疗小鼠的切脂均质中，对C.albicans的形态形成有不同作用。尝试此协议时，请记住，肠道含量的稀释优化可确保在不收集碎屑的情况下充分收集肠道代谢物。不要超过二对一介质对肠道含量稀释，并尽可能降低稀释。
这项技术现在正被用来探索肠道中特定的代谢物如何影响催眠剂的发展，使研究人员能够更好地了解肠道代谢物在真菌发病机制中的作用。
