Bu videoda gösterilen protokol bize mantar hiphal morfogenez üzerinde bağırsak metabolitlerinin rolünü anlamak için izin verir. Bu ex vivo tekniği daha fazla veya daha az hiçbir in vitro çalışma çoğaltmak bir şekilde mantar hyphal morfogenez çalışması için bağırsak en yakın yaklaşım. Bu yöntem, bağırsak metabolitlerinin diğer enterik patojenler üzerindeki rolünü incelemek için uygulanabilir.
Otoklavlı sterilize keskin uçlu makas ve forceps kullanarak fareleri inceleyin. Ötenaziden sonra, karın ortaya çıkarmak için tüm uzuvları sabitleyerek bir diseksiyon yüzeyine hayvan güvenli. Kürkün forceps, makas veya bağırsak bölümlerine yapışmasını önlemek için karın bölgesini %70 etanol püskürtün.
Çimdik ve karın tabanında deri bir bölümünü kaldırmak ve ceum veya bağırsak duvarı delinme önlemek için dikkat ederek deri ve altta yatan fasya ile küçük bir kesi oluşturmak için forseps kullanın. Bu kesiği kısmen periton boşluğunu açığa çıkaran göğüs kafesine uzatın, sonra her iki taraftaki ilk kesi noktasından başlayarak yukarı ve yanal olarak uzanan bir kesik yapın. Bu kanatları yanal olarak çekin ve periton boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için diseksiyon yüzeyine sabitleyin.
Bağırsak içeriğinin en büyük miktarda toplanmasını sağlamak için mide ve kalın bağırsağın distal bölgede kesim üstün hale makas kullanırken forceps ile GI yolu ayıklayın. GI yolu çıkarılırken, tek tek bileşenlerin yırtılmasını önlemeye dikkat edin. Onların proksimal ve distal uçlarında mide, ince bağırsak, çekum ve kalın bağırsak ayırın.
Her bölümden bağırsak içeriğinin toplanması için, distal ucunda tek bir kesi yapmak, sonra el ile forseps ile 1.5 mililitremikrosantrifüj tüp içine bağırsak içeriğini dışarı atmak. Ex vivo tahlilleri için numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bir YPD agar plaka üzerine C.albicans SC5314 taze bir kültür Streak ve 30 santigrat derece gecede kuluçka.
Ertesi gün, iki veya üç orta ölçekli bireysel koloniler seçin ve PBS bir mililitre onları yeniden askıya. Dondurucudan dondurulmuş bağırsak içeriğini alın ve 25 santigrat derecede eritin. Yaklaşık 150 miligram bağırsak içeriğini yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve 150 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.
İçgüdüiçeriğini homojenize etmek ve oda sıcaklığında yaklaşık bir dakika oturmasını sağlamak için numuneyi 30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın. Homojenleri üç dakika boyunca 1,000 kez G'de santrifüj edin, sonra süpernatant'ı herhangi bir enkaz aktarmamaya özen terek yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Santrifüj tekrarladıktan sonra, supernatant c.albicans inoculum 10 mikrolitre ekleyin, iyi karıştırın ve 4-5 saat boyunca 37 derece santigrat örnek kuluçka.
C.albicans üzerinde eksojen metabolitlerin etkisini test etmek için, bağırsak içeriği ve PBS karışımı için metabolitlerin istenilen konsantrasyonu ekleyin, sonra yüksek hızda 30 saniye için örnek girdap, 10 dakika oda sıcaklığında oturup izin ve daha önce açıklandığı gibi santrifüj ve aşılama gerçekleştirin. Mantar hücre kültürünü 1,000 kez G'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Numuneleri 15 dakika boyunca %2 PFA'nın 100 mikrolitresinde sabitleyin, ardından santrifüjü tekrarlayın ve süpernatant'ı atın.
El yazması talimatlara göre bir mililitre PBS ile örnekleri iki kez yıkayın, ardından örnekleri oda sıcaklığında 100 mikrolitre PBS'de poliklonal C.albicans antikorile 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fotobeyaztasyondan kaçınmak için loş ışıkta çalışarak numuneyi PBS ile üç kez daha yıkayın. Karanlık bir odada, 1-500 seyreltme anti-tavşan IgG Alexa Fluor 488 antikor içeren PBS 100 mikrolitre 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri kuluçka.
Numuneyi bir mililitre PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve görüntüleme için 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. 20X ve 40X objektif lensler ve yeşil floresan protein filtresi kullanarak floresan görüntüleme mikroskobu ile mantar hücrelerini görüntüleyin. C.albicans mide, ince bağırsak ve tedavi edilmeyen kontrol ve antibiyotik tedavi farelerin kalın bağırsak alınan bağırsak homojenate özleri ex vivo büyüdü, genellikle bir maya morfolojisi ile gelişir.
Ancak, antibiyotik tedavi farelerden cecal ekstresi yetiştirilen, C.albicans kolayca maya ve hyphae formları ile sonuçlanan morfogenez uğrar. Bu antibiyotik tedavisi cecal ortamda değişikliklere neden olduğunu gösterir, Hangi C.Albicans hiphal morfogenezi neden. Antibiyotik le tedavi edilen farelerin sekal homojenate glikoz eksojen eklenmesi büyük bir hiphal gelişimi ex vivo gösterdi.
Bu sonuçlar, antibiyotik tedavisi görmüş farelerin sekal homojenate geri bağırsak metabolitlerinin eklenmesi farklı c.albicans morfogenezi düzenler öneririz. Bu protokolü denerken, bağırsak içeriğinin seyreltilmesinin optimizasyonunun enkaz toplamadan bağırsak metabolitlerinin yeterli şekilde toplanmasını sağladığını unutmayın. İkiye bir ortama-bağırsak içeriği seyreltme aşmayın ve mümkünse daha düşük bir seyreltme hedefleyin.
Bu teknik şimdi bağırsaktaki spesifik metabolitlerin hiphal gelişimini nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılmakta olup, araştırmacıların bağırsak metabolitlerinin mantar patogenezi üzerindeki rolünü daha iyi anlamalarını sağlar.
