이 비디오에서 입증 된 프로토콜은 곰팡이 최면 형태 발생에 대한 장 대사 산물의 역할을 이해할 수 있게합니다. 이 전 생체 내 기술은 체외 연구가 복제할 수 없는 방식으로 곰팡이 최면 형태 발생을 연구하기 위한 장의 가장 가까운 근사치를 더 많거나 적게 합니다. 이 방법은 다른 장내 병원체에 장 대사 산물의 역할을 연구하기 위해 적용 될 수있다.
자동 살균 된 날카로운 말단 가위와 집게를 사용하여 마우스를 해부합니다. 안락사 후, 복부를 노출하기 위해 모든 사지를 고정하여 해부 표면에 동물을 고정. 모피가 집게, 가위 또는 창자 섹션에 달라붙지 않도록 70%에탄올로 복부 부위를 분사하십시오.
집게를 사용하여 복부 의 바닥에 피부 의 한 부분을 꼬집고 들어 올리고 피부와 근본적인 근막을 통해 작은 절개를 만들어 cecum 또는 장 벽을 뚫지 않도록주의하십시오. 복막 구멍을 부분적으로 노출 흉곽에이 컷을 확장 한 다음 양쪽에 초기 절개 지점에서 시작하여 위쪽과 측면으로 확장 절단합니다. 이 플랩을 측면으로 당기고 해부 표면에 고정하여 복막 구멍을 완전히 노출시합니다.
가위를 사용하여 위와 대장의 탈경 부위에서 절단을 보다 우수하게 만드는 동안 위스포프로 위관을 추출하여 가장 많은 양의 장 함량을 수집합니다. 기관을 제거할 때는 개별 구성 요소의 파열을 피하십시오. 위장, 소장, cecum 및 큰 내장을 근위와 탈구 끝에서 분리합니다.
각 섹션에서 창자 내용물의 수집을 위해, 단상 끝에 단일 절개를 한 다음 수동으로 집게와 1.5 밀리리터 미세 센티스 리퍼지 튜브로 장 내침을 추방. 샘플을 영하 80도에서 저장하여 전 생체 내 에세이를 보관하십시오. C.albicans SC5314의 신선한 문화를 YPD 한천 접시에 적시고 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
다음 날, 2~3개의 중간 크기의 개별 식민지를 선택하고 PBS의 1밀리리터로 재보설한다. 냉동고에서 냉동 용기 내용을 검색하고 섭씨 25도에서 해동하십시오. 약 150밀리그램의 장내 함량을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 150마이크로리터의 PBS로 재보선다.
30초 동안 고속으로 샘플을 소용돌이쳐 내장 함량을 균질화하고 실온에서 약 1분 동안 앉을 수 있도록 합니다. 원심분리기는 3분 동안 1, 000회 G에서 균질화한 다음, 상체관을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기어 파편을 옮기지 않도록 주의합니다. 원심분리를 반복한 후, C.albicans 접종의 10 마이크로리터를 상체에 넣고 잘 섞고 샘플을 섭씨 37도에서 4~5시간 동안 배양합니다.
C.albicans에 외인성 대사 산물의 효과를 테스트하기 위해, 창자 함량 및 PBS 혼합물에 대사 산물의 원하는 농도를 추가한 다음 30 초 동안 고속으로 샘플을 소용돌이시키고, 10 분 동안 실온에 앉아서 원심 분리 및 접종을 수행하십시오. 곰팡이 세포 배양을 1, 000회 G에서 2분 동안 원심세포 배양을 원심분리하고 상퍼를 폐기한다. 15분 동안 2%PFA의 100마이크로리터로 샘플을 수정한 다음 원심분리를 반복하고 상신자를 폐기합니다.
원고 방향에 따라 PBS의 1 밀리리터로 샘플을 두 번 세척한 다음, 폴리클론 C.albicans 항체를 사용하여 PBS의 100 마이크로리터에서 실온에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 세 번 더 세척하여 광표백을 피하기 위해 희미한 빛으로 작업합니다. 어두운 방에서, 1 ~ 500 희석에 안티 토끼 IgG 알렉사 플루오 488 항체를 포함하는 PBS의 100 마이크로 리터에서 실온에서 샘플을 배양.
PBS의 1 밀리리터로 샘플을 세 번 세척한 후, PBS의 100 마이크로리터로 샘플을 다시 중단하고 이미징을 위해 96웰 플레이트로 옮기습니다. 20X 및 40X 객관적렌즈와 녹색 형광단백질 필터를 사용하여 형광 이미징 현미경으로 곰팡이 세포를 이미지화합니다. C.albicans가 위장, 소장 및 치료되지 않은 대조군 및 항생제 치료 마우스의 큰 장에서 가져온 장 균질 추출물에서 전 생체 균증이 재배되면 일반적으로 효모 형태로 개발됩니다.
그러나, 항생제 처리된 마우스에서 세칼 추출물에서 재배될 때, C.albicans는 효모와 최해 형태의 결과로 쉽게 형태 발생을 겪는다. 이것은 항생제 처리가 C.Albicans의 최면 형태 발생을 유도하는 cecal 환경에 있는 변경을 일으키는 원인이 된다는 것을 표시합니다. 항생제 처리된 마우스의 세포 균질에 포도당의 외인성 첨가는 대규모 최면 발달 ex vivo를 보였다.
이러한 결과는 항생제 처리된 마우스의 세포 균주에 다시 창자 대사산물의 추가가 C.albicans의 형태발생을 차별화적으로 조절한다는 것을 건의합니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 장 내 내용의 희석을 최적화하면 잔해 수집없이 장 대사 산물을 충분히 수집할 수 있습니다. 2대 1 미디어-투-용기 콘텐츠 희석을 초과하지 말고 가능하면 희석을 낮추도록 목표로 하십시오.
이 기술은 어떻게 창 자 충격 하이픈 개발에 특정 대사 산물 을 탐구 하기 위해 지금 사용 되 고, 연구원 더 나은 곰 팡이 병 신에 창 자 대사 산물의 역할을 이해할 수 있도록.
