O protocolo demonstrado neste vídeo nos permite entender o papel dos metabólitos intestinais na morfogênese húfa fúngica. Esta técnica ex vivo mais ou menos a aproximação mais próxima do intestino para estudar morfogênese hifagal fúngica de uma forma que nenhum estudo in vitro pode replicar. Este método pode ser aplicado para estudar o papel dos metabólitos intestinais em outros pat pato patógenos entéricos.
Disseque camundongos usando tesouras e fórceps esterilizados autoclavados. Após a eutanásia, segure o animal em uma superfície de dissecção, fixando todos os membros para expor o abdômen. Pulverize a região abdominal com 70% de etanol para evitar que os peles grudem em fórceps, tesouras ou seções intestinais.
Use fórceps para beliscar e levantar uma seção da pele na base do abdômen e criar uma pequena incisão através da pele e fáscia subjacente tomando cuidado para evitar perfurar o ceco ou parede intestinal. Este corte até a caixa torácica expondo parcialmente a cavidade peritoneal, em seguida, faça um corte começando no ponto da incisão inicial de ambos os lados e estendendo-se para cima e lateralmente. Puxe estes retalhos lateralmente e fixe-os à superfície dissecando para expor totalmente a cavidade peritoneal.
Extrair o trato GI com fórceps enquanto usa a tesoura para fazer cortes superiores ao estômago e na região distal do intestino grosso para garantir a coleta da maior quantidade de conteúdo intestinal. Ao remover o trato GI, tome cuidado para evitar a ruptura dos componentes individuais. Separe o estômago, intestino delgado, ceco e intestino grosso em suas extremidades proximais e distais.
Para a coleta de conteúdo intestinal de cada seção, faça uma única incisão na extremidade distal e, em seguida, expela manualmente o conteúdo intestinal em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com fórceps. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius para ensaios ex vivo. Traço uma nova cultura de C.albicans SC5314 em uma placa de ágar YPD e incuba-lo durante a noite a 30 graus Celsius.
No dia seguinte, escolha duas ou três colônias individuais de médio porte e resuspensá-las em um mililitro de PBS. Recupere o conteúdo do intestino congelado do congelador e descongele-os a 25 graus Celsius. Transfira aproximadamente 150 miligramas de conteúdo intestinal em um novo tubo de 1,5 mililitro e resuspensá-los com 150 microliters de PBS.
Vórtice a amostra em alta velocidade por 30 segundos para homogeneizar o conteúdo intestinal e permitir que ele fique em temperatura ambiente por cerca de um minuto. Centrifugar os homogeneiza a 1.000 vezes G por três minutos, depois transfira o supernasce para um novo tubo de 1,5 mililitro, tomando o cuidado de não transferir nenhum detrito. Depois de repetir a centrifugação, adicione 10 microlitadores do inóculo c.albicans ao supernacante, misture bem e incubar a amostra a 37 graus Celsius por quatro a cinco horas.
Para testar o efeito de metabólitos exógenos em C.albicans, adicione a concentração desejada de metabólitos ao conteúdo intestinal e mistura de PBS, em seguida, vórtice da amostra em alta velocidade por 30 segundos, deixe-a sentar-se à temperatura ambiente por 10 minutos, e realizar centrifugação e inoculação como descrito anteriormente. Centrifugar a cultura das células fúngicas a 1.000 vezes G por dois minutos e descartar o supernante. Fixar as amostras em 100 microliters de 2%PFA por 15 minutos, depois repita a centrifugação e descarte o supernatante.
Lave as amostras duas vezes com um mililitro de PBS de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente em 100 microliters de PBS com anticorpo policclonal C.albicans por 30 minutos. Após a incubação, lave a amostra mais três vezes com PBS, trabalhando em luz fraca para evitar fotobleaching. Em uma sala escura, incubar as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos em 100 microliters de PBS contendo anticorpos IgG Alexa Fluor 488 anti-coelho em uma diluição de um a 500.
Depois de lavar a amostra três vezes com um mililitro de PBS, resuspensá-la em 100 microliters de PBS e transferi-la para uma placa de 96 poços para imagem. Imagem das células fúngicas com um microscópio de imagem de fluorescência usando lentes objetivas 20X e 40X e um filtro de proteína fluorescente verde. Quando os c.albicans são cultivados ex vivo em extratos homogeneados intestinais retirados do estômago, intestinos delgados e intestinos grandes de controle não tratado e camundongos tratados com antibióticos, ele geralmente se desenvolve com uma morfologia de levedura.
No entanto, quando cultivados no extrato cecal de camundongos tratados com antibióticos, os c.albicans prontamente sofrem morfogênese resultando em formas de levedura e hifa. Isso indica que o tratamento com antibióticos causa alterações no ambiente cecal, que induzem morfogênese hifalina de C.Albicans. A adição exógena de glicose ao homogeneado cecal de camundongos tratados com antibióticos mostrou um desenvolvimento hisfálico maciço ex vivo.
Esses resultados sugerem que a adição de metabólitos intestinais de volta ao cecal homogenate dos camundongos tratados com antibióticos regula diferencialmente a morfogênese dos c.albicanos. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a otimização da diluição do conteúdo intestinal garante coleta suficiente de metabólitos intestinais sem coleta de detritos. Não exceda uma diluição de conteúdo de mídia para intestino de dois para um e almejar uma diluição menor, se possível.
Esta técnica está sendo usada agora para explorar como metabólitos específicos no desenvolvimento do hyphal de impacto intestinal, permitindo que os pesquisadores compreendam melhor o papel dos metabólitos intestinais na patogênese fúngica.
