البروتوكول الذي أظهر في هذا الفيديو يسمح لنا لفهم دور الأيضات الأمعاء على تكوين الأمعاء الواصلة. هذه التقنية السابقة vivo أكثر أو أقل التقريب الأقرب من القناة الهضمية لدراسة التشوهات الفطرية الواصلة بطريقة لا يمكن تكرارها في المختبر الدراسة. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة دور الأيضات الأمعاء على مسببات الأمراض المعوية الأخرى.
تشريح الفئران باستخدام الأوتكفا المعقمة مقص حاد النهاية والملقط. بعد القتل الرحيم ، قم بتأمين الحيوان على سطح تشريح عن طريق تثبيت جميع الأطراف لفضح البطن. رش منطقة البطن مع 70٪ الإيثانول لمنع الفراء من التمسك ملقط, مقص, أو أقسام الأمعاء.
استخدام ملقط لقرصة ورفع قسم من الجلد في قاعدة البطن وخلق شق صغير من خلال الجلد والزفافة الكامنة مع الحرص على تجنب ثقب الأعوس أو جدار الأمعاء. تمديد هذا القطع إلى القفص الصدري جزئيا تعريض تجويف البريتوني، ثم جعل قطع بدءا من نقطة الشق الأولي على جانبي وتمتد صعودا وشقيا. سحب هذه اللوحات بشكلٍ ثُمّيًا، وثبّتها على سطح التشريح لفضح التجويف البريتوني بشكل كامل.
استخراج الجهاز الهضمي مع ملقط أثناء استخدام مقص لجعل تخفيضات متفوقة على المعدة وفي منطقة القاصي من الأمعاء الغليظة لضمان جمع أكبر قدر من محتوى الأمعاء. عند إزالة الجهاز الهضمي، يجب الحرص على تجنب تمزق المكونات الفردية. فصل المعدة والأمعاء الدقيقة وال cecum والأمعاء الغليظة في نهاياتها القريبة وفص.
لجمع محتويات الأمعاء من كل قسم، وجعل شق واحد في نهاية القاصي، ثم طرد محتوى الأمعاء يدويا في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر مع ملقط. تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية لتذوق الجسم الحي السابقين. المتتالية ثقافة جديدة من C.albicans SC5314 على لوحة YPD أجار واحتضانه بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
في اليوم التالي، اختر مستعمرتين أو ثلاث مستعمرات فردية متوسطة الحجم وأعيد تعليقها في ملليلتر واحد من PBS. استرداد محتويات الأمعاء المجمدة من الثلاجة وذوبانها في 25 درجة مئوية. نقل ما يقرب من 150 ملليغرام من محتويات الأمعاء إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر و resuspend لهم مع 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
دوامة العينة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية لتجانس محتويات الأمعاء والسماح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة تقريبا. الطرد المركزي المتجانس في 1،000 مرات G لمدة ثلاث دقائق، ثم نقل فائقة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر جديدة مع الحرص على عدم نقل أي حطام. بعد تكرار الطرد المركزي، إضافة 10 ميكرولترات من inoculum C.albicans إلى supernatant، اخلط جيدا، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات.
لاختبار تأثير الأيضات الخارجية على C.albicans، إضافة التركيز المطلوب من الأيض إلى محتوى الأمعاء وخليط PBS، ثم دوامة العينة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية، والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وتنفيذ الطرد المركزي والتطعيم كما هو موضح سابقا. الطرد المركزي في ثقافة الخلية الفطرية في 1،000 مرات G لمدة دقيقتين وتجاهل افرا. إصلاح العينات في 100 ميكرولترات من 2٪ PFA لمدة 15 دقيقة، ثم كرر الطرد المركزي وتجاهل السوبر.
غسل العينات مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع الأجسام المضادة C.albicans بوليكلونال لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، وغسل العينة ثلاث مرات أخرى مع برنامج تلفزيوني ، والعمل في ضوء خافت لتجنب photobleaching. في غرفة مظلمة، احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على المضادة للأرانب IgG اليكسا فلور 488 في تخفيف واحد إلى 500.
بعد غسل العينة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، resuspend في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى لوحة 96-جيدا للتصوير. صور الخلايا الفطرية مع مجهر التصوير الفلوري باستخدام العدسات 20X و 40X الهدف ومرشح البروتين الفلورسنت الأخضر. عندما يتم زراعة C.albicans السابقين في مستخلصات متجانسة الأمعاء مأخوذة من المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة من السيطرة غير المعالجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، فإنه يتطور بشكل عام مع مورفولوجيا الخميرة.
ومع ذلك ، عندما تزرع في مستخلص cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، يخضع C.albicans بسهولة إلى تكوين المورفين مما يؤدي إلى أشكال الخميرة والهيبا. وهذا يشير إلى أن العلاج بالمضادات الحيوية يسبب تغييرات في بيئة cecal، مما يؤدي إلى morphogenesi الواصلة من C.Albicans. إضافة خارجية للجلوكوز إلى تجانس cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية أظهرت تطور الواصلة الضخمة السابقين.
هذه النتائج تشير إلى أن إضافة الأيض الأمعاء العودة إلى تجانس cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ينظم بشكل تفاضلي morphogenesis من C.albicans. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن تحسين تخفيف محتوى الأمعاء يضمن مجموعة كافية من المستقلبات الأمعاء دون جمع الحطام. لا تتجاوز تخفيف محتوى من اثنين إلى واحد من الوسائط إلى الأمعاء، وتهدف إلى تخفيف أقل إذا كان ذلك ممكناً.
يتم استخدام هذه التقنية الآن لاستكشاف كيفية المستقلبات المحددة في تطور الواصلة تأثير الأمعاء، مما يسمح للباحثين لفهم أفضل لدور المستقلبات الأمعاء على التسبب الفطري.
