利用单分子定位显微镜分析人类 iPSC 衍生肌细胞中的α-Actinin 网络

该方法可用于对 iPSC 衍生心肌细胞中沙体成熟进行定量评估。使用这种基于分辨率的超级方法，可以检测出沙康组织中的细微变化，这在传统的共声成像中是不可能的。使用前至少三小时，打开显微镜，将样品置于室温。

当显微镜准备就绪时，将 300 微升 PALM 成像缓冲液添加到标记的细胞井中，并将腔室幻灯片插入显微镜的舞台支架中。选择 1.57 NA 100X 油目标，并在成像软件中使用 PALM 模式并激活 TIRF 设置。将帧数设置为 5，000 至 10，000，将 UV 激光功率设置为 0.1%，将 647 激光器设置为 0.2%，将增益级别设置为 50 至 100。

设置所有采集参数后，打开激光照明并选择目标单元。要获取图像，请将 647 激光功率提高至 100%，将增益减小到零。漂白目标细胞约五秒钟，然后将增益增加至50，然后启动PALM图像采集。

对于PALM数据的重建，在采集结束时，打开 ImageJ 中的数据并打开雷雨插件。在插件中选择运行分析并打开摄像机设置菜单。输入像素大小和电磁增益。

在运行分析菜单中，将B样条顺序设置为三，B样条比例为二，峰值强度阈值为stfwave。f1，拟合半径为三，初始西格玛为1.6，放大到5，更新频率为50，横向移到2，然后单击"确定"。重建后，在绘图直方图菜单中选择西格玛，并使用矩形工具选择感兴趣的区域，但不包括可能的工件。将感兴趣区域添加到筛选器中，并将小于 25 的不确定点添加到感兴趣值区域。

在"删除重复项"选项卡中，输入 10 纳米的距离阈值。在合并选项卡中，将最大距离设置为 20，将每个分子的最大帧设置为零，将最大关闭帧设置为 1。在漂移校正选项卡中，选择交叉关联，将条柱数和放大率设置为 5，然后保存最终的 PALM 图像并导出后处理数据。

要分析沙康长度，请将重建的感兴趣的PALM图像导入 ImageJ，并使用线条工具在垂直于 Z-disc 的选定 sarcomere 结构之间绘制一条线，以测量行为丝之间的最短距离。在分析菜单中，选择绘图轮廓并获取两个峰值之间的长度。要分析 Z-disc 厚度，请将重建的 PALM 图像转换为八位模式图像，然后打开 Ridge 检测插件。

将线宽设置为 20，将高对比度设置为 230，将低对比度设置为 10，将西格玛设置为 0.79，将下半阈值设置为 25.84，将最小线长设置为 20。选择估计宽度、延伸线和显示结果，然后单击"确定"并使用结果表中的均线宽度进行进一步分析。iPSC衍生的心肌细胞和新生儿细胞表现出类似的α行为素模式与不规则的不安排的沙康体结构。

定量评估表明，两组细胞之间几乎相同的α作用素丝的长度和厚度，表明 iPSC 衍生的心肌细胞发育过早。相比之下，成年成熟心肌细胞表现出常规的沙康网络，具有略大的沙康长度和减少的Z-disc厚度。比较传统的共体成像和PALM，发现沙康长度没有显著差异。

然而，当 iPSC 心肌细胞进行 PALM 成像时，检测到 Z 盘厚度的显著降低。应用 PALM 时观察到分辨率的增益，相应的强度图支持。值得注意的是，与在最佳成像条件下捕获的结构相比，使用低质量缓冲器获得的沙康结构似乎更厚。

数据准确性的缺乏是由于荧光团的闪烁性能降低，导致每个定位事件检测到的光子更少。此外，定位精度降低，降低了重建的PALM图像的整体分辨率。此外，样品漂移会影响荧光分子的精确定位，从而导致图像模糊。

为了获得正确的PALM图像，让整个成像系统的热平衡以避免成像过程中样品过度漂移是非常重要的。按照这个程序，其他细胞结构，如线粒体可以由PALM成像，以获得心肌细胞成熟的其他参数。