Этот метод может быть использован для количественной оценки созревания саркомера в кардиомиоцитах, полученных iPSC. Используя этот подход, основанный на супер разрешении, можно обнаружить даже тонкие изменения в саркомерной организации, что невозможно с помощью обычных конфокальных изображений. По крайней мере за три часа до использования включите микроскоп и доввеку образца до комнатной температуры.
Когда микроскоп будет готов, добавьте 300 микролитров буфера изображения PALM в колодец помеченных клеток и вставьте камеру слайда в держатель сцены микроскопа. Выберите цель масла 1.57 NA 100X и используйте режим PALM в программном обеспечении для визуализации и активируйте настройки TIRF. Установите количество кадров до 5000 до 10 000, УФ-лазерную мощность до 0,1% и лазер 647 до 0,2% и уровень усиления до 50 до 100.
Когда все параметры приобретения будут установлены, включите лазерное освещение и выберите целевую ячейку. Чтобы получить изображение, увеличьте мощность лазера 647 до 100% и уменьшите прирост до нуля. Отбеливать целевую ячейку в течение примерно пяти секунд, затем увеличить прирост до 50 и инициировать приобретение изображения PALM.
Для восстановления данных PALM, в конце приобретения, откройте данные в ImageJ и откройте плагин Thunderstorm. Выберите анализ запуска в плагине и откройте меню настройки камеры. Введите размер пикселя и электромагнитный прирост.
В меню анализа запуска установите заказ B-spline до трех, шкала B-spline до двух, порог пиковой интенсивности для stfwave. f1, радиус установки до трех, начальная сигма до 1,6, увеличение до пяти, частота обновления до 50, а также боковое смещение на два, и нажмите OK. После реконструкции выберите сигму в меню гистограммы сюжета и используйте прямоугольный инструмент для выбора области интереса, исключая возможные артефакты. Добавьте область интереса к фильтру и добавьте и неопределенность менее 25 в область значений интересов.
В вкладке удаления дубликатов введите порог расстояния в 10 нанометров. В вкладке слияния установите максимальное расстояние до 20, максимальные кадры на молекулу до нуля, а максимальный от кадров до одного. В вкладке коррекции дрейфа выберите кросс-корреляцию и установите количество ячеек и увеличения до пяти, а затем сохраните окончательное изображение PALM и экспортьте данные после обработки.
Чтобы проанализировать длину саркомера, импортируйте реконструированное изображение PALM, представляющие интерес, в ImageJ и используйте линейный инструмент, чтобы провести грань между выбранными структурами саркомера перпендикулярно диску для измерения кратчайшего расстояния между актиновыми мисянами. В меню анализа выберите профиль участка и приобретете длину между двумя пиками. Чтобы проанализировать толщину диска, переоборудуем реконструированное изображение PALM в восьми-битное изображение режима и откройте плагин Ridge Detection.
Установите ширину линии до 20, высокий контраст до 230, низкий контраст до 10, сигму до 0,79, нижний порог до 25,84, и минимальная длина линии до 20. Выберите ширину оценки, расширяю строку и результаты отображения, затем нажмите OK и используйте средняя ширина линии из таблицы результатов для дальнейшего анализа. кардиомиоциты и неонатальные клетки, полученные iPSC, имеют аналогичную модель альфа-актинина с нерегулярными дисаррангированными саркомерными структурами.
Количественная оценка показывает, что длина и толщина нитей альфа-актинина почти идентичны между двумя группами клеток, указывающих на преждевременное состояние развития кардиомиоцитов, полученных iPSC. В отличие от этого, взрослые зрелые кардиомиоциты обладают регулярной саркомерной сетью со слегка увеличенной длиной саркомера и уменьшенной толщиной диска. Сравнение обычных конфокальных изображений и PALM не показывает существенной разницы в длине саркомера.
Тем не менее, глубокое снижение толщины диска обнаруживается, когда iPSC кардиомиоциты подвергаются PALM изображений. При применении PALM наблюдается увеличение разрешения, которое поддерживается соответствующими участками интенсивности. Примечательно, что саркомерные структуры, приобретенные с использованием низкого качества буфера, как представляется, толще по сравнению со структурами, захваченными в оптимальных условиях изображения.
Такое отсутствие точности данных обусловлено снижением мигающих свойств фторфора, что приводит к уменьшению количества обнаруженных фотонов на событие локализации. Кроме того, снижается точность локализации, что снижает общее разрешение реконструированного изображения PALM. Кроме того, дрейф образца может повлиять на точную локализацию флуоресцентных молекул, что приводит к размытым изображениям.
Чтобы получить надлежащие изображения PALM, очень важно, чтобы тепловое равновесие всей системы визуализации, чтобы избежать чрезмерного дрейфа образца во время изображения. После этой процедуры, другие клеточные структуры, такие как митохондрии могут быть изображены PALM, чтобы получить дополнительные параметры созревания кардиомиоцитов.
