Cette méthode peut être utilisée pour l’évaluation quantitative de la maturation du sarcome chez les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC. En utilisant cette approche basée sur la super résolution, il est possible de détecter même des altérations subtiles de l’organisation du sarcome, ce qui n’est pas possible avec l’imagerie confocal conventionnelle. Au moins trois heures avant l’utilisation, allumez le microscope et apportez l’échantillon à température ambiante.
Lorsque le microscope est prêt, ajouter 300 microlitres de tampon d’imagerie PALM à un puits de cellules étiquetées et insérer la glissière de chambre dans le support de scène du microscope. Sélectionnez l’objectif d’huile 1.57 NA 100X et utilisez le mode PALM dans le logiciel d’imagerie et activez les paramètres TIRF. Réglez le nombre d’images à 5000 à 10 000, la puissance laser UV à 0,1% et le laser 647 à 0,2% et le niveau de gain à 50 à 100.
Lorsque tous les paramètres d’acquisition ont été définis, allumez l’éclairage laser et sélectionnez une cellule cible. Pour acquérir une image, augmenter la puissance laser 647 à 100% et réduire le gain à zéro. Blanchir la cellule cible pendant environ cinq secondes, puis augmenter le gain à 50 et lancer l’acquisition de l’image PALM.
Pour la reconstruction des données PALM, à la fin de l’acquisition, ouvrez les données d’ImageJ et ouvrez le plugin Thunderstorm. Sélectionnez l’analyse d’exécuter dans le plugin et ouvrez le menu d’installation de la caméra. Entrez la taille des pixels et le gain électromagnétique.
Dans le menu d’analyse de course, réglez l’ordre B-spline à trois, l’échelle B-spline à deux, le seuil d’intensité maximale à stfwave. f1, le rayon d’ajustement à trois, le sigma initial à 1,6, le grossissement à cinq, la fréquence de mise à jour à 50, et les changements laraux à deux, et cliquez sur OK. Après la reconstruction, sélectionnez sigma dans le menu histogramme de l’intrigue et utilisez l’outil rectangle pour sélectionner une région d’intérêt, à l’exclusion des artefacts possibles. Ajouter la région d’intérêt au filtre et ajouter et l’incertitude de moins de 25 à la région des valeurs d’intérêt.
Dans l’onglet supprimer les doublons, entrez un seuil de distance de 10 nanomètres. Dans l’onglet fusion, réglez la distance maximale à 20, les images maximales par molécule à zéro, et le maximum hors cadres à un. Dans l’onglet correction de dérive, sélectionnez la corrélation croisée et définissez le nombre de bacs et le grossissement à cinq, puis enregistrez l’image PALM finale et exportez les données post-processus.
Pour analyser la longueur du sarcomere, importez l’image PALM reconstruite d’intérêt dans ImageJ et utilisez l’outil de ligne pour tracer une ligne entre les structures de sarcomere sélectionnées perpendiculairement au disque Z pour mesurer la distance la plus courte entre les filaments d’actine. Dans le menu d’analyse, sélectionnez le profil de l’intrigue et acquérez la longueur entre les deux pics. Pour analyser l’épaisseur du disque Z, convertissez l’image PALM reconstruite en une image en mode huit bits et ouvrez le plugin Ridge Detection.
Réglez la largeur de la ligne à 20, le contraste élevé à 230, le faible contraste à 10, le sigma à 0,79, le seuil inférieur à 25,84, et la longueur minimale de la ligne à 20. Sélectionnez la largeur de l’estimation, prolongez la ligne et affichez les résultats, puis cliquez sur OK et utilisez la largeur moyenne de la ligne à partir de la table de résultats pour une analyse plus approfondie. Les cardiomyocytes et les cellules néonatales dérivés de l’iPSC présentent un modèle similaire d’actinine alpha avec des structures sarcomere désarrangées irrégulières.
L’évaluation quantitative démontre que la longueur et l’épaisseur des filaments d’actinine alpha sont presque identiques entre les deux groupes de cellules indiquant un état développemental prématuré des cardiomyocytes iPSC-dérivés. En revanche, les cardiomyocytes matures adultes présentent un réseau régulier de sarcomere avec une longueur légèrement accrue de sarcomere et une épaisseur réduite de Z-disc. Une comparaison de l’imagerie confocale conventionnelle et de PALM ne révèle aucune différence significative dans la longueur du sarcomère.
Cependant, une épaisseur réduite profonde de Z-disc est détectée quand les cardiomyocytes d’iPSC sont soumis à l’imagerie de PAUME. Un gain de résolution est observé lors de l’application du PALM, qui est soutenu par les parcelles d’intensité correspondantes. Notamment, les structures sarcomere acquises à l’aide d’un tampon de mauvaise qualité semblent être plus épaisses que les structures capturées dans des conditions d’imagerie optimales.
Ce manque de précision des données est dû à la réduction des propriétés clignotantes du fluorophore, ce qui réduit le nombre de photons détectés par événement de localisation. En outre, la précision de localisation est diminuée, abaissant la résolution globale de l’image PALM reconstruite. En outre, la dérive de l’échantillon peut affecter la localisation précise des molécules fluorescentes résultant en images floues.
Pour acquérir des images PALM appropriées, il est très important de permettre l’équilibrage thermique de l’ensemble du système d’imagerie afin d’éviter une dérive excessive de l’échantillon pendant l’imagerie. Après cette procédure, d’autres structures cellulaires telles que les mitochondries peuvent être photographiées par PALM pour acquérir des paramètres supplémentaires de maturation des cardiomyocytes.
