Diese Methode kann für die quantitative Bewertung der Sarcomere-Reifung in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten verwendet werden. Mit diesem super Auflösungs-basierten Ansatz ist es möglich, auch subtile Veränderungen in der Sarcomere-Organisation zu erkennen, was mit konventioneller konfokaler Bildgebung nicht möglich ist. Mindestens drei Stunden vor Gebrauch das Mikroskop einschalten und die Probe auf Raumtemperatur bringen.
Wenn das Mikroskop fertig ist, fügen Sie 300 Mikroliter PALM-Bildgebungspuffer in einen Brunnen von beschrifteten Zellen ein und legen Sie das Kammerschlitten in den Bühnenhalter des Mikroskops ein. Wählen Sie das Ölobjektiv 1.57 NA 100X aus, verwenden Sie den PALM-Modus in der Bildverarbeitungssoftware und aktivieren Sie die TIRF-Einstellungen. Stellen Sie die Anzahl der Frames auf 5.000 bis 10.000, die UV-Laserleistung auf 0,1 % und den 647-Laser auf 0,2 % und die Verstärkungsstufe auf 50 bis 100.
Wenn alle Erfassungsparameter eingestellt sind, schalten Sie die Laserbeleuchtung ein und wählen Sie eine Zielzelle aus. Um ein Bild zu erhalten, erhöhen Sie die 647 Laserleistung auf 100 % und reduzieren Sie den Gewinn auf Null. Bleichen Sie die Zielzelle für etwa fünf Sekunden, erhöhen Sie dann den Gewinn auf 50 und initiieren Sie die PALM-Bildaufnahme.
Für die Rekonstruktion der PALM-Daten, am Ende der Erfassung, öffnen Sie die Daten in ImageJ und öffnen Sie das Thunderstorm Plugin. Wählen Sie die Ausführungsanalyse im Plugin aus und öffnen Sie das Kamera-Setup-Menü. Geben Sie die Pixelgröße und die elektromagnetische Verstärkung ein.
Legen Sie im Menü für die Ausführungsanalyse die B-Spline-Reihenfolge auf drei, die B-Spline-Skala auf zwei, die Spitzenintensitätsschwelle auf stfwave fest. f1, der Anpassungsradius auf drei, das anfängliche Sigma auf 1,6, die Vergrößerung auf fünf, die Aktualisierungsfrequenz auf 50 und die seitliche Verschiebung auf zwei, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie nach der Rekonstruktion Sigma im Diagrammhistogrammmenü aus, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Interessenbereich auszuwählen, der mögliche Artefakte ausschließt. Fügen Sie dem Filter die Interessenregion hinzu, und fügen Sie der Region mit Zinswerten weniger als 25 hinzu.
Geben Sie auf der Registerkarte Duplikate entfernen einen Abstandsschwellenwert von 10 Nanometern ein. Legen Sie in der Registerkarte Zusammenführen den maximalen Abstand auf 20, die maximalen Frames pro Molekül auf Null und die maximalen Off-Frames auf einen. Wählen Sie auf der Registerkarte Driftkorrektur die Kreuzkorrelation aus, und legen Sie die Anzahl der Abschnitte und die Vergrößerung auf fünf fest, speichern Sie dann das endgültige PALM-Bild und exportieren Sie die Post-Process-Daten.
Um die Sarkome-Länge zu analysieren, importieren Sie das rekonstruierte PALM-Bild von Interesse in ImageJ und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie zwischen den ausgewählten Sarcomere-Strukturen senkrecht zur Z-Scheibe zu zeichnen, um den kürzesten Abstand zwischen den Aktin-Filamenten zu messen. Wählen Sie im Analysemenü das Diagrammprofil aus und erfassen Sie die Länge zwischen den beiden Spitzen. Um die Dicke der Z-Disc zu analysieren, konvertieren Sie das rekonstruierte PALM-Bild in ein Acht-Bit-Modus-Bild und öffnen Sie das Ridge Detection Plugin.
Legen Sie die Linienbreite auf 20, den hohen Kontrast auf 230, den niedrigen Kontrast auf 10, das Sigma auf 0,79, den unteren Schwellenwert auf 25,84 und die minimale Linienlänge auf 20 fest. Wählen Sie die Vorkalkulationsbreite aus, erweitern Sie die Linie und zeigen Sie die Ergebnisse an, klicken Sie dann auf OK, und verwenden Sie die mittlere Linienbreite aus der Ergebnistabelle für die weitere Analyse. iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten- und Neonatalzellen weisen ein ähnliches Alpha-Actinin-Muster mit unregelmäßig enden den sarkomre Strukturen auf.
Die quantitative Bewertung zeigt, dass Länge und Dicke der Alpha-Actinin-Filamente zwischen den beiden Zellgruppen nahezu identisch sind, was auf einen vorzeitigen Entwicklungszustand von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten hindeutet. Im Gegensatz dazu weisen erwachsene reife Kardiomyozyten ein regelmäßiges Sarcomere-Netzwerk mit einer leicht erhöhten Sarcomere-Länge und reduzierter Z-Scheibendicke auf. Ein Vergleich der konventionellen konfokalen Bildgebung und PALM zeigt keinen signifikanten Unterschied in der Sarcomere-Länge.
Eine tief reduzierte Z-Scheibendicke wird jedoch erkannt, wenn iPSC-Kardiomyozyten der PALM-Bildgebung unterzogen werden. Eine Auflösungszunahme wird beobachtet, wenn PALM angewendet wird, was von den entsprechenden Intensitätsdiagrammen unterstützt wird. Insbesondere Sarcomere-Strukturen, die mit einem Puffer niedriger Qualität erworben wurden, scheinen dicker zu sein als Strukturen, die unter optimalen bildgebenden Bedingungen erfasst wurden.
Dieser Mangel an Datengenauigkeit ist auf die reduzierten Blinkeigenschaften des Fluorophors zurückzuführen, was zu weniger erkannten Photonen pro Lokalisierungsereignis führt. Darüber hinaus wird die Lokalisierungsgenauigkeit verringert, wodurch die Gesamtauflösung des rekonstruierten PALM-Bildes verringert wird. Darüber hinaus kann probendrift die genaue Lokalisierung der fluoreszierenden Moleküle beeinflussen, was zu verschwommenen Bildern führt.
Um richtige PALM-Bilder zu erfassen, ist es sehr wichtig, eine thermische Ausgleichehebung des gesamten Bildgebungssystems zu ermöglichen, um übermäßige Probendrift während der Bildgebung zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können andere zelluläre Strukturen wie Mitochondrien von PALM abgebildet werden, um zusätzliche Parameter der Kardiomyozytenreifung zu erhalten.
