이 방법은 iPSC 유래 심근세포에서 sarcomere 성숙의 정량적 평가를 위해 사용될 수있다. 이 슈퍼 해상도 기반 접근 방식을 사용하여 기존의 공초점 이미징으로는 불가능한 sarcomere 조직에서 미묘한 변화를 감지 할 수 있습니다. 사용하기 최소 3시간 전에 현미경을 켜고 샘플을 실온으로 가져옵니다.
현미경이 준비되면, 표지된 세포의 우물에 PALM 화상 진찰 완충제의 300 마이크로리터를 추가하고 현미경의 단계 홀더에 챔버 슬라이드를 삽입합니다. 1.57 NA 100X 오일 목표를 선택하고 이미징 소프트웨어에서 PALM 모드를 사용하여 TIRF 설정을 활성화합니다. 프레임 수를 5, 000 ~ 10, 000으로 설정하고 UV 레이저 전력을 0.1%로 설정하고 647 레이저는 0.2%로, 게인 레벨을 50~100으로 설정합니다.
모든 획득 파라미터가 설정된 경우 레이저 조명을 켜고 대상 셀을 선택합니다. 이미지를 얻으려면 647 레이저 전력을 100%로 늘리고 게인을 0으로 줄입니다. 대상 셀을 약 5초 동안 표백한 다음 게인을 50으로 늘리고 PALM 이미지 수집을 시작합니다.
PALM 데이터의 재구성을 위해 수집이 끝나면 ImageJ의 데이터를 열고 뇌우 플러그인을 엽니다. 플러그인에서 실행 분석을 선택하고 카메라 설정 메뉴를 엽니다. 픽셀 크기와 전자기 게인을 입력합니다.
실행 분석 메뉴에서 B-스플래라인 순서를 3개로 설정하고 B-스플래라인 배율을 2로 설정하여 피크 강도 임계값을 스tfwave로 설정합니다. f1, 피팅 반지름을 3로, 초기 시그마가 1.6으로, 5로 배율, 업데이트 빈도가 50으로, 측면 이동을 2로 이동하고, 확인을 클릭한다. 재구성 후 플롯 히스토그램 메뉴에서 시그마를 선택하고 사각형 도구를 사용하여 가능한 아티팩트를 제외한 관심 영역을 선택합니다. 관심 영역을 필터에 추가하고 관심 영역 영역에 25 미만의 불확실성을 추가합니다.
제거 중복 탭에서 10나노미터의 거리 임계값을 입력합니다. 병합 탭에서 최대 거리를 20으로 설정하고 분자당 최대 프레임을 0으로 설정하고 최대 오프 프레임을 하나로 설정합니다. 드리프트 보정 탭에서 상호 상관 관계를 선택하고 저장소 수와 배율을 5개로 설정한 다음 최종 PALM 이미지를 저장하고 프로세스 후 데이터를 내보냅니다.
사리필 길이를 분석하려면, 관심의 재구성 된 PALM 이미지를 ImageJ로 가져오고 라인 도구를 사용하여 Z 디스크에 수직으로 선택한 사혜성 구조 사이의 선을 그려 액틴 필라멘트 사이의 가장 짧은 거리를 측정합니다. 분석 메뉴에서 플롯 프로파일을 선택하고 두 피크 사이의 길이를 획득합니다. Z 디스크 두께를 분석하려면 재구성된 PALM 이미지를 8비트 모드 이미지로 변환하고 능선 감지 플러그인을 엽니다.
선 폭을 20으로 설정하고, 대비가 높고 대비가 낮고 10, 시그마가 0.79로, 낮은 임계값은 25.84로, 최소 선 길이를 20으로 설정한다. 예상 폭, 확장 선 및 표시 결과를 선택한 다음 확인을 클릭하고 결과 표에서 평균 선 너비를 사용하여 추가 분석을 합니다. iPSC 유래 심근세포 및 신생아 세포는 불규칙한 분리 된 sarcomere 구조와 유사한 알파 액틴 패턴을 나타낸다.
정량적 평가는 알파 액틴 필라멘트의 길이와 두께가 iPSC 유래 심근세포의 조기 발달 상태를 나타내는 세포의 두 그룹 간에 거의 동일하다는 것을 보여줍니다. 대조적으로, 성인 성숙한 심근세포는 약간 증가한 sarcomere 길이및 감소된 Z 디스크 두께를 가진 정규 sarcomere 네트워크를 전시합니다. 기존의 공초점 이미징과 PALM의 비교는 사코레 길이에 큰 차이가 없음을 보여줍니다.
그러나 iPSC 심근세포가 PALM 이미징을 받을 때 심오하게 감소된 Z 디스크 두께가 검출됩니다. PALM가 적용될 때 해상도의 게인이 관찰되며, 이는 해당 강도 플롯에 의해 지원됩니다. 특히, 낮은 품질의 버퍼를 사용하여 획득한 sarcomere 구조는 최적의 이미징 조건하에서 포착된 구조에 비해 두껍게 보입니다.
이러한 데이터 정확도 의 부족은 플루오로포어의 깜박임 특성이 감소하여 현지화 이벤트당 감지된 광자를 줄이기 때문입니다. 또한, 국소화 정밀도가 감소하여 재구성된 PALM 이미지의 전체 해상도를 낮춥춥시다. 또한, 샘플 드리프트는 흐릿한 심상을 초래하는 형광 분자의 정확한 국소화에 영향을 미칠 수 있다.
적절한 PALM 이미지를 획득하려면 이미징 중에 과도한 샘플 드리프트를 방지하기 위해 전체 이미징 시스템의 열 평형을 허용하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라, 미토콘드리아와 같은 그밖 세포 구조물은 심근세포 성숙의 추가 파라미터를 취득하기 위하여 PALM에 의해 심상화될 수 있습니다.
