从鸡胚胎的直膜到研究棒到锥细胞相互作用的锥形丰富文化

这种方法用于研究锥体受体，这是日光视力所必需的。这些方法的优点是，它使用受精鸡蛋，这是容易获得的，是主要锥培养的唯一来源之一。该协议用于识别棒源性锥体可生存因子，这是未来有希望的治疗遗传性视网膜退化的方法。

此外，该协议还用于研究锥形光感受器的新陈代谢。通过仔细遵循所述协议，其专长在初级细胞培养方面的个人，只需经过几次尝试就能获得圆锥体丰富文化。首先从工业孵化场收集每周受精卵。

将受精卵保持在实验室的17摄氏度。对于每种培养物，在20摄氏度下24小时孵育7个受精卵，然后在37摄氏度的潮湿室中孵育136小时，间歇性地回归倾角。要恢复鸡胚胎，用消毒剂清洗鸡蛋表面，用大直钳在蛋壳顶部打个洞，然后切开蛋壳，从鸡蛋上取下帽子。

用弯曲的钳子轻轻地从蛋壳中提取每个胚胎，然后转移到含有以前加热到37摄氏度的无菌PBS的培养皿中。小心地取出环绕胚胎的信封。通过与汉堡和汉密尔顿的视觉比较验证每个胚胎的发育阶段，并在发育的第29阶段选择两个胚胎，使这些选定的胚胎的眼睛被激发出来，并将其转移到二氧化碳独立的介质中。

在二氧化碳独立介质中工作，位置四眼角膜朝下，视神经朝实验者。用两个直钳在视神经上钻一个洞。在视网膜和色素上皮之间插入每个钳子的一个分支，然后拉动和旋转眼睛，将上皮从视网膜中分离。

取出角膜，然后是镜片和角膜。将四个视网膜转移到含有林格介质的培养皿中，pH 7.2。使用两个直钳将四个视网膜切成非常小的碎片，并用林格的介质洗两次。

第二次洗涤后，让小管碎片掉到管子底部，并移除介质。在37摄氏度下用Trypsin溶液治疗视网膜片20分钟。20分钟后，停止反应，添加文化媒体补充10%灭活的胎儿小腿血清。

用 0.05 毫克的 DNase 1 孵化细胞悬架，然后立即用移液器上下管道分离细胞簇和 DNA。用化学定义培养介质或 CDM 清洗视网膜细胞悬架两次。在37摄氏度下，用透明底和聚氨酯处理两个黑色96井培养板两小时。

完成后，用 M199 培养介质冲洗两次板。将Trypan蓝色添加到细胞悬架的10微升的别名中，以染色活细胞。然后将细胞悬浮标本添加到血细胞仪中。

在计算细胞后，使用 CDM 将细胞悬浮到适当的浓度。添加分子库的 50 微升，使用预先定义的模式进行筛选。将两个细胞悬架的50微升种子放入两个预处理的黑色96井培养板中。

用多通道移液器从板的右侧向左分配板中的细胞，使每个柱子之间均匀。然后在37摄氏度下孵化板块7天，低于5%的二氧化碳，没有媒体变化。为了计算可行的细胞，在板的每个井中加入2.7微摩尔钙素AM和0.3毫摩尔乙酸乙二甲酸钠同质化物。

在没有光线的情况下，在室温下将盘子孵化一小时。阅读自动板读取器上的荧光，该读卡器由倒置显微镜组成，配备有 485 和 520 纳米两个激发滤镜的汞灯、520 和 635 纳米的两个排放滤清器以及充电耦合设备摄像头。该协议用于筛选一个标准化的cDNA库，该库由胆汁和视网膜色素上皮组成，由8周大的长埃文斯鼠的400只眼睛组成。

共评估了2，112套100个克隆，相当于211，200个个体克隆。在42个比例大于2的克隆池中，0080和0073的活性比7天培养后的负控制高16倍和14倍。从100个克隆中选出的每一个被细分为16组10个克隆从他们的甘油库存。

子池 0073-09 提供了最强的生存率，并细分为产生 16 个单独的克隆，在第三轮锥体丰富培养物筛选中进行了测试。克隆 0073-09-37 以 2.5 的生存率脱颖而出。进一步分析证实，这种克隆对圆锥体的生存有强大和可重复的影响。

试验独立重复，并按顺序插入1.8千基。生物信息分析显示，克隆0073-09-37，即名为"甲基二甲酸-衍生锥体生存因子"，或EdCVF，包含三个开放读取帧。独立测试时，只有ORF1对圆锥体产生保护作用。

ORF1是作为谷胱甘肽S-转移酶蛋白生产的。上皮衍生的锥体生存因子被纯化，GST 标签被移除。营养活动的分析表明，EdCVF能够防止圆锥体丰富的培养系统中的锥体变性。

在尝试此过程时，应仔细检查胚胎的发育阶段，以便获得圆锥体丰富的培养物。按照这个协议，细胞可以用质粒DNA电波化，以研究任何生存因素的分子机制，如RdCVF。这项技术为代谢研究铺平了道路，包括锥体生存数学模型的开发。