Этот метод используется для изучения конусных рецепторов, которые необходимы для дневного зрения. Преимущество методов в том, что в нем используются оплодотворенные куриные яйца, которые легко доступны, и являются одним из единственных источников первичных конусных культур. Протокол был использован для идентификации фактора жизнеспособности конуса, полученного из палочки, будущего перспективного лечения наследственной дегенерации сетчатки.
Кроме того, протокол использовался для изучения метаболизма колбочих фоторецепторов. Тщательно следуя описанной протоколу, человек, чей опыт находится в первичной клеточной культуре, должен иметь возможность получить обогащенную колбочником культуру всего после нескольких попыток. Начните со сбора еженедельно оплодотворенных яиц из промышленного инкубатория.
Поддерживайте оплодотворенные яйцеклетки при 17 градусах Цельсия в лаборатории. Для каждой культуры высиживают семь оплодотворенных яиц в течение 24 часов при 20 градусах Цельсия, а затем 136 часов при 37 градусах Цельсия в увлажненной камере с прерывистым возвратом наклона. Чтобы восстановить куриные эмбрионы, промыть поверхность яиц дезинфицирующим средством, разбить яичную скорлупу, сделав отверстие в верхней части скорлупы крупными прямыми плоскогубцами, затем разрезать скорлупу, чтобы снять шляпку с яйца.
Осторожно извлеките каждый эмбрион из яичной скорлупы изогнутыми щипцами и перенесите его в чашку Петри, содержащую стерильный PBS, предварительно нагретый до 37 градусов Цельсия. Осторожно снимите оболочку, которая окружает эмбрионы. Проверьте стадию развития каждого эмбриона путем визуального сравнения с Гамбургером и Гамильтоном и выберите два эмбриона на 29-й стадии развития Энуклеат глаза этих отобранных эмбрионов и перенесите их в среду, независимую от углекислого газа.
Работая в среде, не зависятой от углекислого газа, расположите четыре глаза лицом к роговице вниз, а зрительный нерв лицом к экспериментатору. Просверлите отверстие в зрительном нерве с помощью двух прямых щипцов. Вставьте ветвь каждого щипца между сетчаткой и пигментным эпителием, затем потяните и поверните глаз, чтобы оторвать эпителий от сетчатки.
Удалите роговицу, затем хрусталик и стекловидное стекло. Перенесите четыре сетчатки в чашку Петри, содержащую среду Рингера при рН 7,2. Разрежьте четыре сетчатки на очень маленькие кусочки, используя два прямых плоскогубца, и дважды вымойте кусочки средой Рингера.
После второго промывания дайте кусочкам сетчатки упасть на дно трубки и удалите мочку. Обработать кусочки сетчатки раствором трипсина в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Через 20 минут остановите реакцию, добавив культуральную жиму, дополненную 10% инактивированной сывороткой для телят плода.
Инкубируют клеточную суспензию с 0,05 мг ДНКазы 1 Затем немедленно диссоциируют клеточные кластеры и ДНК, пипетируя вверх и вниз пипеткой. Промыть суспензию клеток сетчатки дважды химически определенной питательной средой или CDM. Обработать два черных 96-скважинных культуральных пластин с прозрачным дном полилизином в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.
По завершении дважды промойте пластины питательной средой M199. Добавьте трипан синий к аликвоте в 10 микролитров клеточной суспензии, чтобы окрасить живые клетки. Затем добавьте образец клеточной суспензии на гемоцитометр.
После подсчета клеток доведите клеточную суспензию до соответствующих концентраций с помощью CDM. Добавьте 50 микролитров библиотеки молекул, которые будут экранированы с использованием предопределенного шаблона. Посеять 50 микролитров двухклеточных суспензий в две предварительно обработанные черные 96-лунонные культуральная пластина.
Распределите ячейки по пластинам многоканальной пипеткой справа от пластины к левой, гомогенизируя между каждой колонкой. Затем инкубируют пластины в течение семи дней при 37 градусах Цельсия, менее 5% углекислого газа без изменения среды. Чтобы подсчитать жизнеспособные клетки, добавьте 2,7 микромолярный кальциин AM и 0,3 миллимолярного гомодимера этидия в каждую скважину пластины.
Инкубировать пластины в течение одного часа при комнатной температуре при отсутствии света. Считывание флуоресценции на автоматизированном пластинчатом считывателе, состоящем из перевернутого микроскопа, оснащенного ртутной лампой с двумя фильтрами возбуждения на 485 и 520 нанометров, двумя эмиссионными фильтрами на 520 и 635 нанометров и камерой устройства с зарядовой связью. Этот протокол был использован для скрининга нормализованной библиотеки кДНК, состоящей из пигментированного эпителия сосудистой оболочки и сетчатки из 400 глаз восьминедельных крыс Лонг-Эванса.
Всего было оценено 2 112 наборов из 100 клонов, соответствующих 211 200 отдельным клонам. Среди 42 пулов клонов с соотношением больше двух пулы 0080 и 0073 имели коэффициент жизнеспособности в 16 и 14 раз выше, чем отрицательный контроль после семи дней культивирования. Каждый из 100 клонов был разделен на 16 наборов по 10 клонов из их глицеринового запаса.
Подгруппа 0073-09 дала самый сильный коэффициент жизнеспособности и была подразделена на 16 отдельных клонов, которые были протестированы в третьем раунде скрининга на культурах, обогащенных конусами. Клон 0073-09-37 выделялся коэффициентом жизнеспособности 2,5. Дальнейший анализ подтвердил, что этот клон оказывает надежное и воспроизводимое влияние на выживание конуса.
Испытание повторяли независимо и секвенировали вставку из 1,8 килобаз. Биоинформатический анализ показал, что клон 0073-09-37, который был назван фактором жизнеспособности конуса эпителия, или EdCVF, содержит три открытых кадра считывания. При независимом тестировании только ORF1 оказывал защитное действие на колбок.
ORF1 продуцировали как белок глутатион S-трансферазы. Фактор жизнеспособности конуса эпителия был очищен, а метка GST была удалена. Анализ трофической активности показал, что EdCVF способен предотвращать конусную дегенерацию в системе культур, обогащенной конусами.
При попытке этой процедуры следует тщательно проверить стадию развития эмбрионов, чтобы получить обогащенные конусами культуры. Следуя этому протоколу, клетки могут быть электропорированы плазмидной ДНК для изучения молекулярных механизмов любых факторов выживания, таких как RdCVF. Этот метод прокладывает метаболические исследования, включая разработку математических моделей выживания конуса.
