この方法は、昼間の視力に不可欠なコーン受容体を研究するために使用されます。.方法の利点は、それが簡単にアクセス可能である受精鶏卵を使用していることです, そして、主要なコーン培養の唯一のソースの一つ.このプロトコルは、遺伝性の残性変性に対する将来の有望な治療法であるロッド由来コーン生存率因子を同定するために使用された。
さらに、このプロトコルは、錐体の感光体代謝を研究するために使用された。記載されたプロトコルに注意深く従うことによって、一次細胞培養における専門知識を持つ個人は、数回の試みだけでコーン濃縮培養を得ることができるべきである。工業用孵化場から毎週受精卵を採取することから始めます。
受精卵を17°Cで実験室で維持する。各培養ごとに、7個の受精卵を摂氏20度で24時間、加湿室で摂氏37度で136時間、傾斜が断続的に反転します。鶏の胚を回収するには、卵の表面を消毒剤で洗い、大きなまっすぐなペンチで殻の上部に穴を開けて卵殻を割り、殻を切って卵から帽子を取り除きます。
卵殻から各胚を湾曲した鉗子でそっと抽出し、以前に摂氏37度に加熱した滅菌PBSを含むペトリ皿に移します。胚を取り囲む封筒を慎重に取り除きます。ハンブルガーとハミルトンとの視覚的な比較によって各胚の発達段階を確認し、開発の第29段階で2つの胚を選択し、これらの選択された胚の目を核とし、二酸化炭素非依存媒体に移す。
二酸化炭素非依存媒体で働き、角膜を下に向け、視神経を実験者に向けた4つの目を配置する。2つのストレート鉗子を使用して視神経に穴を開けます。網膜と色素上皮の間に各鉗子の枝を挿入し、眼を引いて回転させて網膜から上皮を取り外す。
角膜を取り除き、続いてレンズとガラス膜を取り除きます。4つのレチナをpH 7.2でリンガーの媒体を含むペトリ皿に移します。2つのまっすぐなペンチを使用して非常に小さな部分に4つのレチナをカットし、リンガーの媒体で2回洗浄します。
2回目の洗浄後、レティナの破片をチューブの底に落とし、培地を取り除きます。トリプシンの溶液で37°Cで20分間、レチナルピースを扱います。20分後、10%不活性化胎児の子牛血清を添加した培養培地を添加して反応を停止する。
DNase 1の0.05mgで細胞懸濁液をインキュベートし、ピペットで上下にピペット処理を行い、細胞クラスターとDNAをすぐに解約する。レチン細胞懸濁液を化学的に定義された培養培地またはCDMで2回洗浄します。ポリリシンを含む透明な底を持つ2つの黒い96ウェル培養プレートを摂氏37度で2時間扱います。
終了したら、M199培地でプレートを2回リンスします。細胞懸濁液の10マイクロリットルのアリコートにトリパンブルーを加えて、生きている細胞を染色する。その後、細胞懸濁液の標本をヘモサイトメーターに加えます。
細胞を計数した後、CDMを用いて細胞懸濁液を適切な濃度に持ち込む。あらかじめ定義されたパターンを使用してスクリーニングされる分子のライブラリーの50マイクロリットルを加える。2つの細胞懸濁液の50マイクロリットルを2つの前処理された黒い96ウェル培養プレートに種付けします。
プレートの右側から左側にマルチチャンネルピペットを使用してプレート内のセルを分配し、各カラム間で均質化します。その後、培地を変えずに5%の二酸化炭素の下で、摂氏37度で7日間プレートをインキュベートします。生存細胞を数えるために、プレートの各ウェルに2.7ミクロモルカルセインAMと0.3ミリモルエチジウムホモジマーを加えます。
光がなさらなくて室温でプレートを1時間インキュベートする。485および520ナノメートルの2つの励起フィルター、520および635ナノメートルの2つの放出フィルターおよび電荷結合された装置のカメラが付いている水銀ランプが装備されている逆の顕微鏡で構成される自動版の読者の蛍光を読む。このプロトコルは、生後8週間の400眼から脈絡膜および網膜色素上皮で作られた正規化されたcDNAライブラリをスクリーニングするために使用されたロングエバンスラット。
211に対応する100クローンの合計2,112セットを、200個の個別クローンを評価した。2つを超える比率を有するクローンの42プールのうち、プール0080および0073は、培養7日後の負の対照よりも生存率比が16および14倍高い。100クローンの各選択は、それらのグリセロールストックから10クローンの16セットに細分化された。
サブプール0073-09は最も強い生存率を与え、コーン濃縮培養物のスクリーニングの第3ラウンドで試験された16個のクローンを作製するために細分化された。クローン0073-09-37は2.5の生存率の比率で際立っていた。さらなる分析は、このクローンがコーン生存に対して堅牢で再現性のある効果を有することを確認した。
テストは独立して繰り返され、1.8キロベースの挿入を配列した。バイオインフォマティクス分析の結果、上皮由来円錐生存率因子と名付けられたクローン0073-09-37、またはEdCVFには3つのオープンリーディングフレームが含まれていることが明らかになった。独立して試験した場合、ORF1だけがコーンに対して保護効果を発揮した。
ORF1はグルタチオンSトランスファーゼタンパク質として製造した。上皮由来のコーン生存率因子を精製し、GSTタグを除去した。栄養活性の分析は、EdCVFがコーンエンリッチ培養系におけるコーン変性を防ぐことができることを実証した。
この手順を試みる場合、胚の発達段階は、コーン濃縮培養を得るために慎重にチェックする必要があります。このプロトコルに従って、細胞をプラスミドDNAで電気ポレートして、RdCVFのような生存因子の分子機構を研究することができる。この技術は、コーン生存の数学的モデルの開発を含む代謝研究の開拓を行う。
