Cette méthode est utilisée pour étudier les récepteurs coniques qui sont essentiels pour la vision de la lumière du jour. L’avantage des méthodes est qu’elles utilisent des œufs de poule fécondés, facilement accessibles et l’une des seules sources de cultures de cônes primaires. Le protocole a été employé pour identifier le facteur rod-dérivé de viabilité de cône, un futur traitement prometteur pour la dégénérescence rétinienne héritée.
En outre, le protocole a été employé pour étudier le métabolisme de photorécepteur de cône. En suivant attentivement le protocole décrit, une personne dont l’expertise est dans la culture cellulaire primaire, devrait être en mesure d’obtenir la culture enrichie de cône après seulement quelques tentatives. Commencez par collecter chaque semaine des œufs fécondés dans une écloserie industrielle.
Maintenez les œufs fécondés à 17 degrés Celsius en laboratoire. Pour chaque culture, incuber sept œufs fécondés pendant 24 heures à 20 degrés Celsius, puis 136 heures à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée avec réversion intermittente de l’inclinaison. Pour récupérer les embryons de poulet, lavez la surface des œufs avec du désinfectant, cassez la coquille de l’œuf en faisant un trou au sommet de la coquille avec de grandes pinces droites, puis coupez la coquille pour enlever le chapeau de l’œuf.
Extrayez doucement chaque embryon de la coquille d’œuf avec une pince incurvée et transférez-le dans une boîte de Petri contenant du PBS stérile préalablement chauffé à 37 degrés Celsius. Retirez soigneusement l’enveloppe qui entoure les embryons. Vérifier le stade de développement de chaque embryon par comparaison visuelle avec Hamburger et Hamilton et sélectionner deux embryons au 29ème stade de développement Enucleate les yeux de ces embryons sélectionnés et les transférer dans un milieu indépendant du dioxyde de carbone.
Travaillant dans un milieu indépendant du dioxyde de carbone, positionnez quatre yeux avec la cornée vers le bas et le nerf optique vers l’expérimentateur. Percez un trou dans le nerf optique à l’aide de deux pinces droites. Insérez une branche de chaque pince entre la rétine et l’épithélium pigmentaire, puis tirez et faites pivoter l’œil pour détacher l’épithélium de la rétine.
Retirez la cornée, puis le cristallin et le vitré. Transférer les quatre rétines dans une boîte de Petri contenant le milieu de Ringer à un pH de 7,2. Coupez les quatre rétines en très petits morceaux à l’aide de deux pinces droites et lavez les morceaux deux fois avec le milieu de Ringer.
Après le deuxième lavage, laissez les morceaux de rétine tomber au fond du tube et retirez le support. Traiter les morceaux rétiniennes avec une solution de Trypsine pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après 20 minutes, arrêtez la réaction en ajoutant des milieux de culture complétés par 10% de sérum de veau fœtal inactivé.
Incuber la suspension cellulaire avec 0,05 mg de DNase 1 Puis dissocier immédiatement les grappes cellulaires et l’ADN en pipetant de haut en bas avec une pipette. Laver la suspension cellulaire rétinienne deux fois avec un milieu de culture chimiquement défini ou un MDP. Traiter deux plaques de culture noires de 96 puits avec un fond transparent avec de la polylysine pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Lorsque vous avez terminé, rincez les plaques deux fois avec le milieu de culture M199. Ajouter le bleu trypan à une partie aliquote de 10 microlitres de la suspension cellulaire pour tacher les cellules vivantes. Ajoutez ensuite l’échantillon de suspension cellulaire à un hémocytomètre.
Après avoir compté les cellules, amenez la suspension cellulaire aux concentrations appropriées à l’aide de CDM. Ajoutez 50 microlitres de la bibliothèque de molécules à examiner à l’aide d’un motif prédéfini. Ensemencer les 50 microlitres des deux suspensions cellulaires dans les deux plaques de culture noires prétraitées de 96 puits.
Distribuez les cellules dans les plaques avec une pipette multicanal de la droite de la plaque vers la gauche, en homogénéisant entre chaque colonne. Incuber ensuite les plaques pendant sept jours à 37 degrés Celsius, sous 5% de dioxyde de carbone sans changement de support. Pour compter les cellules viables, ajoutez 2,7 calcines micromolaires AM et 0,3 homodimer millimolaire d’éthidium à chaque puits de la plaque.
Incuber les plaques pendant une heure à température ambiante en l’absence de lumière. Lisez la fluorescence sur un lecteur de plaque automatisé composé d’un microscope inversé équipé d’une lampe à mercure avec deux filtres d’excitation à 485 et 520 nanomètres, deux filtres d’émission à 520 et 635 nanomètres et une caméra à couplage de charge. Ce protocole a été employé pour examiner une bibliothèque normalisée de cDNA faite de l’épithélium pigmenté choroïde et rétinien de 400 yeux d’un huit semaines, rats de Long-Evans.
Au total, 2 112 ensembles de 100 clones correspondant à 211 200 clones individuels ont été évalués. Parmi les 42 pools de clones dont le rapport est supérieur à deux, les pools 0080 et 0073 présentaient un rapport de viabilité 16 et 14 fois supérieur au témoin négatif après sept jours de culture. Chacun des 100 clones sélectionnés a été subdivisé en 16 ensembles de 10 clones de leur stock de glycérol.
Le sous-pool 0073-09 a donné le ratio de viabilité le plus fort et a été subdivisé pour produire 16 clones individuels qui ont été testés lors d’une troisième série de criblage sur des cultures enrichies en cônes. Le clone 0073-09-37 s’est démarqué avec un rapport de viabilité de 2,5. Une analyse plus approfondie a confirmé que ce clone a un effet robuste et reproductible sur la survie des cônes.
L’essai a été répété indépendamment et l’insertion de 1,8 kilobase a été séquencée. Une analyse bioinformatique a révélé que le clone 0073-09-37, qui a été nommé Epithelium-Derived Cone Viability Factor, ou EdCVF contient trois cadres de lecture ouverts. Lorsqu’il a été testé indépendamment, seul ORF1 a exercé un effet protecteur sur les cônes.
ORF1 a été produit comme protéine de glutathion S-transférase. Le facteur de viabilité épithélium-dérivé de cône a été purifié et l’étiquette GST a été enlevée. L’analyse de l’activité trophique a démontré que l’EdCVF est capable de prévenir la dégénérescence du cône dans le système de culture enrichi en cônes.
Lors de la tentative de cette procédure, le stade de développement des embryons doit être soigneusement vérifié afin d’obtenir les cultures enrichies en cônes. Suivant ce protocole, les cellules peuvent être électroporées avec de l’ADN plasmidique pour étudier les mécanismes moléculaires de tout facteur de survie tel que le RdCVF. Cette technique ouvre la voie à la recherche métabolique, y compris le développement de modèles mathématiques de survie des cônes.
