Este método se utiliza para estudiar los receptores de cono que son esenciales para la visión de la luz del día. La ventaja de los métodos es que utiliza huevos de gallina fertilizados, que son de fácil acceso, y una de las únicas fuentes de cultivos de conos primarios. El protocolo fue utilizado para identificar el factor de viabilidad del cono Barra-derivado, un tratamiento prometedor futuro para la degeneración retiniana heredada.
Además, el protocolo fue utilizado para estudiar metabolismo del fotorreceptor del cono. Siguiendo cuidadosamente el protocolo descrito, un individuo cuya maestría está en cultivo celular primario, debe poder obtener la cultura enriquecida cono después de solamente algunas tentativas. Comience por recolectar huevos fertilizados semanalmente de una planta de incubación industrial.
Mantener los óvulos fertilizados a 17 grados centígrados en el laboratorio. Para cada cultivo, incubar siete huevos fertilizados durante 24 horas a 20 grados Centígrados, y luego 136 horas a 37 grados Centígrados en una cámara humidificada con reversión intermitente de la inclinación. Para recuperar los embriones de pollo, lave la superficie de los huevos con desinfectante, rompa la cáscara de huevo haciendo un agujero en la parte superior de la cáscara con grandes alicates rectos, luego corte la cáscara para quitar el sombrero del huevo.
Extraiga suavemente cada embrión de la cáscara de huevo con fórceps curvos y transfilícelo a una placa de Petri que contenga PBS estéril previamente calentado a 37 grados Celsius. Retire con cuidado la envoltura que rodea a los embriones. Verifique la etapa de desarrollo de cada embrión por comparación visual con Hamburger y Hamilton y seleccione dos embriones en la etapa 29 de desarrollo Enucleate los ojos de estos embriones seleccionados y transfiételos a un medio independiente del dióxido de carbono.
Trabajando en un medio independiente del dióxido de carbono, coloque cuatro ojos con la córnea hacia abajo y el nervio óptico hacia abajo y el nervio óptico hacia el experimentador. Perfore un agujero en el nervio óptico usando dos tórceps rectos. Inserte una rama de cada tórceps entre la retina y el epitelio pigmentario, luego tire y gire el ojo para separar el epitelio de la retina.
Retire la córnea, seguida del cristalino y el vítreo. Transfiera las cuatro retinas a una placa de Petri que contenga el medio de Ringer a pH 7.2. Corte las cuatro retinas en trozos muy pequeños usando dos alicates rectos y lave los trozos dos veces con el medio de Ringer.
Después del segundo lavado, deje que los pedazos de retina caigan a la parte inferior del tubo y retire el medio. Trate las piezas retinianas con una solución de tripsina durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Después de 20 minutos, detenga la reacción agregando medios de cultivo complementados con suero de ternero fetal inactivado al 10%.
Incubar la suspensión celular con 0,05 mg de DNasa 1 Luego disociar inmediatamente los grupos celulares y el ADN pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta. Lave la suspensión de células de la retina dos veces con un medio de cultivo químicamente definido o MDL. Trate dos placas de cultivo negras de 96 pocillos con un fondo transparente con polilesina durante dos horas a 37 grados Centígrados.
Cuando termine, enjuague las placas dos veces con el medio de cultivo M199. Agregue trypan azul a una alícuota de 10 microlitros de la suspensión celular para manchar las células vivas. Luego agregue la muestra de suspensión celular a un hemocitómetro.
Después de contar las células, lleve la suspensión celular a las concentraciones apropiadas usando CDM. Añadir 50 microlitros de la biblioteca de moléculas a tamizar utilizando un patrón predefinido. Sembra los 50 microlitros de las suspensiones de dos células en las dos placas de cultivo negras pretratadas de 96 pozos.
Distribuya las celdas de las placas con una pipeta multicanal desde la derecha de la placa hacia la izquierda, homogeneizando entre cada columna. Luego incuba las placas durante siete días a 37 grados Centígrados, por debajo del 5% de dióxido de carbono sin cambio de medio. Para contar las células viables, agregue 2,7 micromolares de caleína AM y 0,3 milimomolares de etidio homodímero a cada pozo de la placa.
Incubar los platos durante una hora a temperatura ambiente en ausencia de luz. Lea la fluorescencia en un lector de placas automatizado compuesto por un microscopio invertido equipado con una lámpara de mercurio con dos filtros de excitación a 485 y 520 nanómetros, dos filtros de emisión a 520 y 635 nanómetros y una cámara de dispositivo acoplada a carga. Este protocolo fue utilizado para examinar una biblioteca normalizada del cDNA hecha del epitelio pigmentado coroides y retiniano a partir de 400 ojos de ocho semanas viejo, ratas de Largo-Evans.
Se evaluaron un total de 2.112 conjuntos de 100 clones correspondientes a 211.200 clones individuales. Entre los 42 pools de clones con una relación mayor a dos, los pools 0080 y 0073 tuvieron un cociente de viabilidad 16 y 14 veces mayor que el control negativo después de siete días de cultivo. Cada uno seleccionado de 100 clones se subdividió en 16 conjuntos de 10 clones de su stock de glicerol.
El subgrupo 0073-09 dio la relación de viabilidad más fuerte y se subdividió para producir 16 clones individuales que se probaron en una tercera ronda de cribado en cultivos enriquecidos con conos. El clon 0073-09-37 se destacó con una relación de viabilidad de 2,5. Análisis posteriores confirmaron que este clon tiene un efecto robusto y reproducible sobre la supervivencia del cono.
La prueba se repitió de forma independiente y se ordenó el inserto de 1,8 kilobases. Un análisis bioinformático reveló que el clon 0073-09-37, que fue nombrado Epitelio-Derived Cone Viability Factor, o EdCVF contiene tres marcos de lectura abiertos. Cuando está probado independientemente, solamente ORF1 ejerció un efecto protector sobre los conos.
ORF1 fue producido como una proteína S-transferasa de glutatión. El factor epitelio-derivado de la viabilidad del cono fue purificado y la etiqueta de GST fue quitada. El análisis de la actividad trófica demostró que EdCVF es capaz de prevenir la degeneración del cono en el sistema de cultivo enriquecido con el cono.
Al intentar este procedimiento, la etapa de desarrollo de los embriones debe ser cuidadosamente revisada con el fin de obtener los cultivos enriquecidos con el cono. Siguiendo este protocolo, las células pueden ser electroporadas con ADN plásmido para estudiar los mecanismos moleculares de cualquier factor de supervivencia como RdCVF. Esta técnica allana la investigación metabólica, incluido el desarrollo de modelos matemáticos de supervivencia de conos.
