이 방법은 일광 시력에 필수적인 원뿔 수용체를 연구하는 데 사용됩니다. 이 방법의 장점은 쉽게 접근 할 수있는 수정 된 닭 알을 사용하고, 기본 원뿔 문화의 유일한 소스 중 하나라는 것입니다. 프로토콜은 막대 파생 된 콘 생존 요인을 식별하는 데 사용되었다, 상속 망막 변성에 대한 미래의 유망한 치료.
더욱이, 프로토콜은 콘 광수용체 대사를 연구하기 위해 사용되었다. 신중하게 설명 된 프로토콜을 따라, 그의 전문 지식이 1 차 세포 배양에 있는 개별은, 단지 몇 번의 시도 후에 원뿔 농축 된 문화를 얻을 수 있어야 합니다. 산업 부화장에서 매주 수정 된 계란을 수집하여 시작합니다.
실험실에서 17섭씨에서 수정란을 유지하십시오. 각 문화에 대해, 20섭씨 20도에서 24시간 동안 7개의 수정란을 배양한 다음, 간헐적으로 경사를 되찾은 가습된 챔버에서 섭씨 37도에서 136시간 동안 배양합니다. 닭 배아를 복구하려면, 소독제로 계란의 표면을 씻어, 큰 직선 펜치와 껍질의 상단에 구멍을 만들어 계란 껍질을 깰, 다음 계란에서 모자를 제거하기 위해 껍질을 잘라.
각 배아를 구부러진 집게로 달걀 껍질에서 부드럽게 추출하고 이전에 섭씨 37도까지 가열된 멸균 PBS를 함유한 페트리 접시로 옮긴다. 배아를 둘러싼 봉투를 조심스럽게 제거합니다. 각 배아의 개발 단계를 함부르크와 해밀턴에 대한 시각적 비교로 확인하고 개발 29단계에서 2개의 배아를 선택하여 선택하여 선택된 이 배아의 눈을 이핵화하고 이산화탄소 독립적 매체로 옮기다.
이산화탄소 독립적 매체에서 작업하면 각막이 아래로 향하고 실험자가 직면한 시신경으로 4개의 눈을 배치합니다. 두 개의 직선 집게를 사용하여 시신경에 구멍을 뚫습니다. 망막과 안료 상피 사이에 각 집게의 가지를 삽입한 다음 눈을 당기고 회전하여 망막에서 상피를 분리합니다.
각막을 제거하고 렌즈와 유리체가 뒤따릅니다. 4개의 망막을 pH 7.2에서 링거의 매체가 들어있는 페트리 접시에 옮기다. 두 개의 직선 펜치를 사용하여 네 개의 망막을 매우 작은 조각으로 자르고 링거의 매체로 두 번 씻어냅니다.
두 번째 세척 후 망막 조각이 튜브 의 바닥에 떨어지도록하고 미디어를 제거하십시오. 섭씨 37도에서 트립신의 용액으로 망막 조각을 20분 간 치료하십시오. 20 분 후, 10 % 불활성화 태아 종아리 혈청으로 보충 문화 매체를 추가하여 반응을 중지합니다.
세포 현탁액을 0.05 mg의 DNase 1로 배양한 다음 피펫으로 위아래로 피펫을 피펫하여 세포 클러스터와 DNA를 즉시 분리합니다. 화학적으로 정의된 배양 배지 또는 CDM으로 망막 세포 현탁액을 두 번 세척하십시오. 투명 한 바닥으로 두 개의 검은 96 웰 문화 판을 37섭씨에서 2 시간 동안 다립분해처리하십시오.
완료되면 M199 배양 배지로 플레이트를 두 번 헹구는 것입니다. 살아있는 세포를 얼룩지게 하기 위하여 세포 현탁액의 10마이크로리터의 알리쿼트에 Trypan blue를 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액 시편을 혈종계에 추가합니다.
세포를 계산한 후, CDM을 사용하여 셀 현탁액을 적절한 농도로 가져옵니다. 미리 정의된 패턴을 사용하여 선별할 분자 라이브러리의 50마이크로리터를 추가합니다. 2개의 전처리된 검정 96웰 배양 판으로 2개의 세포 현탁액의 50 마이크로리터를 시드합니다.
플레이트의 오른쪽에서 왼쪽으로 다중 채널 파이펫으로 플레이트내의 셀을 분배하여 각 열 간에 균질화합니다. 그런 다음 7일 동안 37°C에서 접시를 배양하고, 미디어가 바뀌지 않고 이산화탄소5% 미만입니다. 실행 가능한 세포를 계산하려면, 플레이트의 각 웰에 2.7 마이크로 몰러 칼세인 AM과 0.3 밀리모라 에디듐 호모디머를 추가합니다.
빛이 없는 경우 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 485 나노미터와 520 나노미터의 두 개의 여기 필터가 장착된 반전된 현미경으로 구성된 자동 플레이트 판독기의 형광을 읽고 520 나노미터와 635 나노미터의 2개의 배출 필터와 충전 결합 장치 카메라로 구성된 다. 이 프로토콜은 8 주 된, 긴 에반스 쥐의 400 눈에서 choroid 및 망막 색소 상피로 만든 정규화된 cDNA 라이브러리를 선별하는 데 사용되었다.
총 2, 112세트의 100클론이 211, 200개의 개별 클론을 평가하였다. 2보다 큰 비율로 클론의 42 풀 중, 풀 0080 과 0073 문화 7 일 후 음의 제어보다 16 및 14 배 높은 생존율을 했다. 각각 100클론을 글리세롤 스톡으로부터 10세트씩 세분화했다.
서브 풀 0073-09는 가장 강한 생존율을 부여하고 콘 농축 문화에 대한 3차 심사에서 테스트된 16개의 개별 클론을 생산하기 위해 세분화되었습니다. 클론 0073-09-37은 2.5의 생존율로 두드러졌습니다. 추가 분석은 이 클론이 원뿔 생존에 강력하고 재현 가능한 효력이 있다는 것을 확인했습니다.
시험은 독립적으로 반복되었고 1.8 킬로베이스의 삽입이 시퀀스되었다. 생물정보학적 분석에 따르면 복제본 0073-09-37은 에피텔륨 유래 콘 생존 능력인 또는 EdCVF에 세 개의 개방 판독 프레임을 포함하고 있습니다. 독립적으로 테스트했을 때 ORF1만이 콘에 보호 효과를 발휘했습니다.
ORF1은 글루타티온 S-트랜스퍼라제 단백질로 제조되었다. 상피 유래 원뿔 생존능력 계수는 정제되었고 GST 태그가 제거되었다. 트로피크 활성의 분석은 EdCVF가 원뿔 농축 배양 시스템에서 원뿔 변성을 방지할 수 있음을 입증하였다.
이 절차를 시도할 때, 태아의 발달 단계는 원뿔이 풍부한 문화를 얻기 위하여 주의 깊게 검토되어야 합니다. 이 프로토콜에 따라, 세포는 RdCVF와 같은 어떤 생존 인자의 분자 기계장치를 연구하기 위하여 플라스미드 DNA로 전포될 수 있습니다. 이 기술은 원뿔 생존의 수학적 모델의 개발을 포함하여 신진 대사 연구의 포장.
