DNA晕片制备物的荧光原位杂交揭示整个染色体、端粒和基因位点

该协议可用于评估核骨架的附着，而不是使用DamID测序，并且它是一种单细胞测定。使用此方法的主要优点是它具有成本效益且易于访问。它可以突出基因和染色体之间的功能差异，而这些差异通常不会在其他可视化技术中发生。

可以使用该协议评估治疗的癌症和早衰细胞基因组内的空间和功能组织以及衰老细胞的基因组行为差异。该方法可以应用于整个生命周期中的任何细胞或组织类型以及任何疾病。它也可以用于有探针的模式生物。

首先，准备500毫升10%盐酸并将其倒入一个大烧杯中。将显微镜载玻片单独放入酸中，并在室温下在设置为两个G的摇床上孵育一小时.从烧杯中倒出酸，并在自来水中洗涤载玻片10次。然后在去离子水中再再10次。

用甲醇冲洗载玻片两次，并将其保存在甲醇中直至灭菌。将载玻片倒在纸巾上晾干，然后用箔纸包裹，以便在高压灭菌器或热烤箱中灭菌。在适当的培养基中用血清在37摄氏度和5%二氧化碳下培养细胞至少48小时，直到达到60%至70%的汇合度。

收获每种细胞类型并使用血细胞计数器计数细胞。在每张载玻片的10毫升培养基中接种1次10至五个细胞。从培养箱中取出含有载玻片和附着细胞的培养皿。

丢弃介质并用铅笔标记幻灯片。然后将它们放入装有50毫升冰冷细胞骨架缓冲液的科普林罐中。将罐子在冰上或 4 摄氏度下孵育 15 分钟。

丢弃细胞骨架缓冲液，并将载玻片浸入装有缓冲液的科普林罐中，在50毫升一次性DNA晕缓冲液中快速冲洗载玻片三次。将载玻片转移到含有50毫升提取缓冲液的科普林罐中，并在室温下孵育四分钟。然后将载玻片在50毫升10次，5次，2次和一次DNA晕缓冲液中连续孵育1分钟。

完成后，将载玻片浸入10%、30%、70%和95%乙醇的顺序乙醇系列中。将载玻片通过 70、90 和 100% 乙醇的连续 50 毫升乙醇系列，每次 5 分钟。在加热板上风干。

然后在 70 摄氏度的烤箱中烘烤五分钟。通过将载玻片置于70%甲酰胺中两次SSC溶液中，在70摄氏度下两分钟来变性载玻片。将变性载玻片放入50毫升冰冷的70%乙醇中五分钟。

然后将它们在室温下通过 90、95 和 100% 的乙醇系列，每次五分钟。完成后，在加热板上风干载玻片。在75摄氏度下使DNA探针在热块或水浴中变性10分钟。

然后将它们在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后将 10 微升移液到适当的载玻片上。用 21 x 21 毫米的盖玻片覆盖探头，并用橡胶水泥密封。将载玻片在37摄氏度下在加湿的杂交室中孵育至少18小时。

孵育后，用镊子小心地取出橡胶水泥。然后将载玻片在 pH 7 的 50 毫升 50% 甲酰胺两倍 SSC 溶液中孵育，该溶液已预热至 45 摄氏度进行三次五分钟的孵育。接下来，将载玻片放入50毫升0.1倍SSC溶液中，该溶液已预热至60摄氏度，但置于45摄氏度的水浴中。

孵育五分钟，更换缓冲液两次，孵育五分钟。将载玻片放入室温下含有50毫升四倍SSC溶液的COPLIN罐中，并用三次更换的缓冲液孵育15分钟。为防止非特异性抗体结合，将100微升4%BSA四倍SSC溶液涂在每张载玻片上，并用一块石蜡膜覆盖。

在室温下孵育10分钟。然后将载玻片与100微升链霉亲和素Cy3在室温下200中稀释1小时，以检测标记的探针。将载玻片放入室温下含有50毫升四倍SSC溶液的COPLIN罐中，并用三次更换的缓冲液孵育15分钟。

将载玻片安装在含有DAPI的20微升安装溶液中，并用22×50毫米的盖玻片覆盖。使用带有100X油物镜的落射荧光显微镜可视化DNA光晕和染色体区域。DNA晕制备可以看到残余细胞核的边缘，残留细胞核内的DNA，以及已经卷入周围区域的未附着DNA。

增殖的人真皮成纤维细胞的DNA晕是由掺入BRDU的细胞产生的，随后用抗BRDU抗体染色。增殖细胞对BRDU和抗pKi-67呈阳性。该协议用于可视化DNA晕中的染色体区域。

用特定的全臂染色体绘画探针标记单个染色体，用于染色体1，13，17和18。抗pKi-67用于标记增殖细胞及其在同一培养物中的缺失。此处显示了端粒为绿色的DNA晕制剂。

可以观察到DNA晕中端粒的比例，特别是在实验二图像中。静止细胞中端粒的平均百分比约为17%。在一级对照成纤维细胞和具有典型和非典型哈钦森-吉尔福德早衰综合征的患病细胞中检测到染色体附着的差异，表达不同的Sun1亚型并且没有层粘连蛋白A突变。

与受控DNA晕相比，1号和13号染色体在残余细胞核内的附着显示出统计学上的显着差异。整个染色体区域的位置与残余细胞核和DNA晕相关。尝试此协议时，请确保以正确的密度接种细胞并在正确的时间提取。

按照这个程序，可以进行间接免疫荧光和RNA FISH。