このプロトコルは、DamIDシーケンシングを使用するのではなく、核骨格への付着を評価するために使用でき、シングルセルアッセイです。この方法を使用する主な利点は、費用対効果が高く、簡単にアクセスできることです。他の可視化技術では通常は発生しない可能性のある遺伝子と染色体の機能の違いを強調することができます。
治療された癌および早老症細胞におけるゲノム内の空間的および機能的組織、ならびに老化細胞におけるゲノム行動の違いは、このプロトコルを使用して評価することができる。この方法は、生涯にわたるあらゆる細胞または組織タイプおよびあらゆる疾患に適用できます。また、プローブが利用可能なモデル生物にも使用できます。
はじめに、500ミリリットルの10%塩酸を準備し、それを大きなビーカーに注ぎます。顕微鏡スライドを個別に酸に滴下し、ビーカーから酸を2Gデカントするように設定したシェーカーで室温で1時間インキュベートし、スライドを水道水で10回洗浄します。その後、脱イオン水中でさらに10回行う。
スライドをメタノールで2回すすぎ、滅菌するまでメタノールに保ちます。スライドをペーパータオルの上に傾けて乾燥させ、オートクレーブまたはホットオーブンで滅菌するためにホイルで包みます。60〜70%のコンフルエンシーに達するまで、血清を含む適切な培地で、摂氏37度および5%二酸化炭素で少なくとも48時間細胞を増殖させます。
各細胞タイプを採取し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。スライドごとに10ミリリットルの培地に5つの細胞に10回播種します。スライドと付着細胞を入れた培養皿をインキュベーターから取り出します。
メディアを廃棄し、鉛筆を使用してスライドにラベルを付けます。次に、50ミリリットルの氷冷細胞骨格バッファーを含むコプリンジャーに入れます。氷の上または摂氏4度で15分間瓶をインキュベートします。
細胞骨格バッファーを廃棄し、バッファーと一緒にコプリンジャーに浸して、50ミリリットルの1回限りのDNAハローバッファーでスライドを3回すばやくすすぎます。スライドを50ミリリットルの抽出バッファーを含むコプリンジャーに移し、室温で4分間インキュベートします。次に、スライドを50ミリリットルの10回、5回、2回、および1回のDNAハローバッファー中でそれぞれ1分間連続してインキュベートします。
終了したら、スライドを10、30、70、および95%エタノールの連続エタノールシリーズに浸します。スライドを70、90、および100%エタノールの連続した50ミリリットルのエタノールシリーズにそれぞれ5分間行います。加温プレートで風乾します。
その後、摂氏70度のオーブンで5分間焼きます。スライドを70%ホルムアミドに2回SSC溶液で70°Cで2分間入れて変性させます。変性したスライドを50ミリリットルの氷冷70%エタノールに5分間入れます。
次に、90、95、および100%のエタノールシリーズを室温でそれぞれ5分間移動します。終了したら、加温プレートでスライドを風乾します。DNAプローブを摂氏75度でホットブロックまたは水浴中で10分間変性させます。
次に、摂氏37度で30分間インキュベートしてから、適切なスライドに10マイクロリットルをピペッティングします。プローブを21 x 21ミリメートルのカバーガラスで覆い、ゴムセメントで密封します。加湿ハイブリダイゼーションチャンバー内で、摂氏37度で最低18時間スライドをインキュベートします。
インキュベーション後、鉗子でゴムセメントを慎重に取り除きます。次に、スライドを50ミリリットルの50%ホルムアミド中で、摂氏45度に予め温めたpH7のSSC溶液中で2回インキュベートし、5分間インキュベートします。次に、スライドを摂氏60度に予熱したが摂氏45度の水浴に入れた50ミリリットルの0.1倍SSC溶液に入れる。
5分間インキュベートし、5分間インキュベーションするためにバッファーを2回交換します。スライドを室温で50ミリリットルの4回SSC溶液を含むコプリンジャーに入れ、3回のバッファー交換で15分間インキュベートします。非特異的抗体の結合を防ぐために、各スライドに100マイクロリットルの4%BSA4倍SSC溶液を塗布し、パラフィンフィルムを重ねます。
室温で10分間インキュベートします。次に、200分の1に希釈した100マイクロリットルのストレプトアビジンCy3でスライドを室温で1時間インキュベートし、標識プローブを検出しました。スライドを室温で50ミリリットルの4回SSC溶液を含むコプリンジャーに入れ、3回のバッファー交換で15分間インキュベートします。
DAPIを含む20マイクロリットルの取り付けソリューションにスライドを取り付け、22 x 50ミリメートルのカバーガラスをオーバーレイします。DNAハローと染色体領域を、100倍の油性対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して可視化します。DNAハロー調製は、残留核の端、残留核内に残っているDNA、および周囲にスプールアウトした未付着DNAを見ることを可能にします。
増殖するヒト皮膚線維芽細胞のDNAハローは、BRDUが組み込まれた細胞から作成され、その後、抗BRDU抗体で染色されました。増殖細胞はBRDUおよび抗pKi-67に対して陽性であった。このプロトコルは、DNAハロー内の染色体領域を視覚化するために使用されました。
個々の染色体は、染色体1、13、17、および18の特定の全腕染色体塗装プローブで標識されました。抗pKi-67は、増殖細胞および同一培養物内でのその不在をマークするために使用された。緑色のテロメアを含むDNAハロー製剤がここに示されています。
DNAハロー中のテロメアの割合、特に実験2枚の画像で観察することができます。テロメアの平均割合は静止細胞で約17%であった。染色体付着の違いは、一次対照線維芽細胞および典型的および非定型ハッチンソン-ギルフォード早老症症候群の罹患細胞で検出され、異なるSun1アイソフォームを発現し、ラミンA変異はなかった。
染色体1および13は、制御されたDNAハローと比較した場合、残留核内でのそれらの付着に統計的に有意な違いを示す。染色体領域全体の位置は、残留核およびDNAハローと相関していた。このプロトコルを試みるときは、細胞が正しい密度で播種され、適切なタイミングで抽出されていることを確認してください。
この手順に続いて、間接免疫蛍光法およびRNA FISHを行うことができる。
