פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת קבצים מצורפים לשלד הגרעין במקום להשתמש בריצוף DamID, וזה מבחן תא בודד. היתרון העיקרי בשימוש בשיטה זו הוא שהיא חסכונית ונגישה בקלות. זה יכול להדגיש הבדלים פונקציונליים בין גנים וכרומוזומים שעשויים שלא להתרחש בדרך כלל עם טכניקות הדמיה אחרות.
ניתן להעריך באמצעות פרוטוקול זה ארגונים מרחביים ותפקודיים בתוך הגנום בתאי סרטן ופרוגריה מטופלים והבדלים התנהגותיים גנומיים בתאים מזדקנים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או רקמה לאורך תוחלת החיים ושל כל מחלה. זה יכול לשמש גם אורגניזמים מודל שבו בדיקות זמינות.
כדי להתחיל, להכין 500 מיליליטר של 10% חומצה הידרוכלורית ויוצקים אותו לתוך גדולה. יש לזרוק את המגלשות במיקרוסקופ בנפרד לתוך החומצה ולדגור עליהן במשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר שנקבע לשני G.Decant את החומצה מהכוס ולשטוף את המגלשות 10 פעמים במי ברז. לאחר מכן 10 פעמים נוספות במים נטולי יונים.
שוטפים את המגלשות במתנול פעמיים ושומרים אותן במתנול עד לעיקור. הטו את המגלשות על מגבת נייר לייבוש ועטפו אותן בנייר כסף לעיקור באוטוקלאבה או בתנור חם. לגדל תאים בתווך המתאים עם סרום לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד 60 עד 70% מפגש הוא הגיע.
קצור כל סוג תא וספור את התאים באמצעות המוציטומטר. זרעו פעם אחת 10 לחמשת התאים ב-10 מיליליטר של מדיום לכל שקופית. מוציאים את צלחת התרבית המכילה את המגלשות והתאים המחוברים מהאינקובטור.
מחק את המדיום ותייג את השקופיות באמצעות עיפרון. לאחר מכן הניחו אותם בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של חיץ שלד ציטו-שלד קר כקרח. דוגרים על הצנצנת במשך 15 דקות על קרח או בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את חיץ השלד הציטו-שלד ושטפו במהירות את השקופיות ב-50 מיליליטר של חיץ הילה חד-פעמי של DNA שלוש פעמים על ידי טבילתם בצנצנת קופלין עם החיץ. מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של חיץ מיצוי ודגרים במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דוגרים ברצף על השקופיות ב-50 מיליליטר של 10 פעמים, חמש פעמים, פעמיים ופעם אחת מאגר הילת DNA למשך דקה אחת כל אחת.
בסיום, טבלו את המגלשות בסדרת אתנול רציפה של 10, 30, 70 ו-95% אתנול. קח את השקופיות דרך סדרה רציפה של אתנול 50 מיליליטר של 70, 90 ו-100% אתנול למשך חמש דקות כל אחת. יבשו אותם באוויר על צלחת חימום.
ואז אופים בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. נטרלו את השקופיות על ידי הכנסתן לפורממיד 70% פעמיים בתמיסת SSC למשך שתי דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. הניחו את המגלשות המפורקות ב-50 מיליליטר אתנול קר כקרח למשך חמש דקות.
לאחר מכן העבירו אותם דרך סדרת אתנול של 90, 95 ו-100% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כל אחד. בסיום, יבשו את המגלשות באוויר על צלחת חימום. דנטורציה של בדיקות DNA ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בלוק חם או אמבט מים.
לאחר מכן לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני pipeting 10 מיקרוליטר על המגלשה המתאימה. כסו את הגשושית בכיסוי 21 על 21 מ"מ ואטמו אותה במלט גומי. דוגרים על המגלשות למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא הכלאה לח.
לאחר הדגירה, בזהירות להסיר את מלט גומי עם מלקחיים. לאחר מכן דוגרים על המגלשות ב-50 מיליליטר של 50% פורממיד פעמיים תמיסת SSC ב-pH שבע שחוממה מראש ל-45 מעלות צלזיוס במשך שלוש דגירות של חמש דקות. לאחר מכן, מקם את המגלשות ב 50 מיליליטר של 0.1 פעמים תמיסת SSC כי כבר מחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס, אבל ממוקם באמבט מים 45 מעלות צלזיוס.
דוגרים במשך חמש דקות ומחליפים את החיץ פעמיים לאינקובציות של חמש דקות. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של תמיסת SSC פי ארבעה בטמפרטורת החדר ודגרים במשך 15 דקות עם שלושה החלפות חיץ. כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים, יש למרוח 100 מיקרוליטר של 4% BSA ארבע פעמים על כל שקופית ולכסות אותה בחתיכת סרט פרפין.
יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן לדגור על שקופיות עם 100 מיקרוליטר של streptavidin Cy3 מדולל אחד ל 200 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לזהות את הבדיקה המסומנת. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של תמיסת SSC פי ארבעה בטמפרטורת החדר ודגרים במשך 15 דקות עם שלושה החלפות חיץ.
הרכיבו את המגלשות ב-20 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה המכילה DAPI ושכבת-על עם כיסוי בגודל 22 על 50 מילימטר. דמיינו הילות DNA ואזורי כרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מטרת שמן 100X. הכנת הילת דנ"א מאפשרת לראות את קצה הגרעין השיורי, את הדנ"א שנותר בתוך הגרעין השיורי, ואת הדנ"א הלא מחובר שזרם החוצה אל הסביבה.
הילות DNA של פיברובלסטים עוריים אנושיים מתרבים נוצרו מתאים עם BRDU משולב ולאחר מכן הוכתמו בנוגדן נגד BRDU. תאים מתרבים היו חיוביים עבור BRDU ואנטי pKi-67. פרוטוקול זה שימש להמחשת טריטוריות כרומוזומים בתוך הילות DNA.
כרומוזומים בודדים סומנו בבדיקות ספציפיות לצביעת כרומוזומי זרוע שלמה עבור כרומוזומים 1, 13, 17 ו-18. Anti-pKi-67 שימש לסימון תאים מתרבים והיעדרם באותה תרבית. תכשירי הילת דנ"א עם טלומרים בירוק מוצגים כאן.
אפשר לראות את שיעור הטלומרים בהילת הדנ"א, במיוחד בניסוי שתי תמונות. האחוז הממוצע של הטלומרים היה כ-17% בתאים שקטים. הבדלים בחיבור הכרומוזומים התגלו בפיברובלסטים של בקרה ראשונית ובתאים חולים עם תסמונת פרוגריה טיפוסית ולא טיפוסית של האצ'ינסון-גילפורד, המבטאים איזופורם Sun1 שונה וללא מוטציה של Lamin A.
כרומוזומים 1 ו-13 מראים הבדלים מובהקים סטטיסטית בהתקשרותם בתוך הגרעינים השיוריים בהשוואה להילות דנ"א מבוקרות. המיקום של כל טריטוריית הכרומוזומים היה מתואם עם הגרעין השיורי והילה של הדנ"א. בעת ניסיון פרוטוקול זה, ודא כי התאים נזרעים בצפיפות הנכונה ומופקים בזמן הנכון.
בעקבות הליך זה, immunofluorescence עקיף ו RNA FISH ניתן לבצע.
