Questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli attaccamenti al nucleoscheletro piuttosto che utilizzare il sequenziamento DamID, ed è un test a singola cellula. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo metodo è che è conveniente e facilmente accessibile. Può evidenziare differenze funzionali tra geni e cromosomi che normalmente non si verificano con altre tecniche di visualizzazione.
Le organizzazioni spaziali e funzionali all'interno del genoma nelle cellule tumorali e progeria trattate e le differenze comportamentali genomiche nelle cellule senescenti possono essere valutate utilizzando questo protocollo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula o tessuto per tutta la durata della vita e di qualsiasi malattia. Può anche essere utilizzato in organismi modello in cui sono disponibili sonde.
Per iniziare, preparare 500 millilitri di acido cloridrico al 10% e versarlo in un grande becher. Far cadere i vetrini del microscopio singolarmente nell'acido e incubarli per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker impostato su due G.Decantare l'acido dal becher e lavare i vetrini 10 volte in acqua di rubinetto. Poi altre 10 volte in acqua deionizzata.
Risciacquare i vetrini in metanolo due volte e tenerli in metanolo fino alla sterilizzazione. Rovesciare i vetrini su un tovagliolo di carta per asciugarli e avvolgerli in un foglio di alluminio per la sterilizzazione in autoclave o forno caldo. Coltivare le cellule nel mezzo appropriato con siero per almeno 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.
Raccogliere ogni tipo di cellula e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seminare una volta 10 alle cinque celle in 10 millilitri di mezzo per vetrino. Rimuovere il piatto di coltura contenente i vetrini e le cellule attaccate dall'incubatore.
Scartare il supporto ed etichettare le diapositive usando una matita. Quindi metterli in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di tampone citoscheletrico ghiacciato. Incubare il barattolo per 15 minuti su ghiaccio o a quattro gradi Celsius.
Scartare il tampone citoscheletrico e sciacquare rapidamente i vetrini in 50 millilitri di tampone alone di DNA una tantum tre volte immergendoli in un barattolo di coplin con il tampone. Trasferire i vetrini in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di tampone di estrazione e incubare per quattro minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare consecutivamente i vetrini in 50 millilitri di 10 volte, cinque volte, due volte e una volta tampone dell'alone di DNA per un minuto ciascuno.
Al termine, immergere i vetrini attraverso una serie sequenziale di etanolo da 10, 30, 70 e 95% di etanolo. Prendi le diapositive attraverso una serie sequenziale di etanolo da 50 millilitri di etanolo 70, 90 e 100% per cinque minuti ciascuna. Asciugarli all'aria su una piastra riscaldante.
Quindi cuocere in forno a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Denaturare i vetrini mettendoli in soluzione di formammide al 70% due volte SSC per due minuti a 70 gradi Celsius. Posizionare i vetrini denaturati in 50 millilitri di etanolo ghiacciato al 70% per cinque minuti.
Quindi spostarli attraverso una serie di etanolo di 90, 95 e 100% a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno. Al termine, asciugare all'aria i vetrini su una piastra riscaldante. Denaturare le sonde di DNA a 75 gradi Celsius per 10 minuti in un blocco caldo o a bagnomaria.
Quindi incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di pipettare 10 microlitri sul vetrino appropriato. Sovrapporre la sonda con un coprislip di 21 x 21 millimetri e sigillarla con cemento di gomma. Incubare i vetrini per un minimo di 18 ore a 37 gradi Celsius in una camera di ibridazione umidificata.
Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il cemento di gomma con una pinza. Quindi incubare i vetrini in 50 millilitri di soluzione di formammide al 50% due volte SSC a pH sette che è stata preriscaldata a 45 gradi Celsius per tre incubazioni di cinque minuti. Quindi, posizionare i vetrini in 50 millilitri di soluzione SSC 0,1 volte che è stata preriscaldata a 60 gradi Celsius, ma posta in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius.
Incubare per cinque minuti e sostituire il buffer due volte per incubazioni di cinque minuti. Mettere i vetrini in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di soluzione quattro volte SSC a temperatura ambiente e incubare per 15 minuti con tre cambi di tampone. Per evitare il legame anticorpale non specifico, applicare 100 microlitri di soluzione 4% BSA quattro volte SSC a ciascun vetrino e sovrapporlo con un pezzo di pellicola di paraffina.
Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi incubare i vetrini con 100 microlitri di streptavidina Cy3 diluita una su 200 per un'ora a temperatura ambiente per rilevare la sonda etichettata. Mettere i vetrini in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di soluzione quattro volte SSC a temperatura ambiente e incubare per 15 minuti con tre cambi di tampone.
Montare le guide in 20 microlitri di una soluzione di montaggio contenente DAPI e sovrapposizione con un coprislip da 22 x 50 millimetri. Visualizza aloni di DNA e territori cromosomici utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo di olio 100X. La preparazione dell'alone di DNA consente di vedere il bordo di un nucleo residuo, il DNA che rimane all'interno del nucleo residuo e il DNA non attaccato che si è insinuato nell'area circostante.
Gli aloni di DNA di fibroblasti dermici umani proliferanti sono stati creati da cellule con BRDU incorporato e successivamente colorati con anticorpi anti-BRDU. Le cellule proliferanti erano positive per BRDU e anti-pKi-67. Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare i territori cromosomici all'interno degli aloni di DNA.
I singoli cromosomi sono stati etichettati con specifiche sonde di pittura cromosomica dell'intero braccio per i cromosomi 1, 13, 17 e 18. Anti-pKi-67 è stato usato per marcare le cellule proliferanti e la sua assenza all'interno della stessa coltura. I preparati di alone di DNA con telomeri in verde sono mostrati qui.
È possibile osservare la proporzione di telomeri nell'alone di DNA, in particolare nell'immagine dell'esperimento due. La percentuale media di telomeri era di circa il 17% nelle cellule quiescenti. Differenze nell'attaccamento cromosomico sono state rilevate nei fibroblasti di controllo primario e nelle cellule malate con sindrome di progeria di Hutchinson-Gilford tipica e atipica, che esprime una diversa isoforma Sun1 e nessuna mutazione di Lamin A.
I cromosomi uno e 13 mostrano differenze statisticamente significative nel loro attaccamento all'interno dei nuclei residui rispetto agli aloni di DNA controllati. La posizione dell'intero territorio cromosomico era correlata al nucleo residuo e all'alone di DNA. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi che le cellule siano seminate alla densità corretta ed estratte al momento giusto.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire immunofluorescenza indiretta e RNA FISH.
